高中生物竞赛蛋白质的共价结构课件.ppt

第一单元第一单元 蛋白质化学蛋白质化学第三章第三章 氨基酸氨基酸第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构第五章第五章 蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构第六章第六章 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系第七章第七章 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征第第4 4章章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构（P P157157)一、蛋白质通论一、蛋白质通论二、肽二、肽三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能五、肽与蛋白质的人工合成五、肽与蛋白质的人工合成 (一一)蛋白质的化学组成和分类蛋白质的化学组成和分类（二）蛋白质的形状和大小（二）蛋白质的形状和大小（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次（三）蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次（四）蛋白质功能的多样（四）蛋白质功能的多样性性一、一、蛋白质通论蛋白质通论（一）蛋白质的化学组成和分类蛋白质的化学组成和分类(P(P157157)N 16%O 23%C 50%H 7%蛋白质含蛋白质含 C 50%H 7%C 50%H 7%O 23%N 16%O 23%N 16%S 0-3%S 0-3%其他微量其他微量 蛋白质含氮量平均为蛋白质含氮量平均为16%16%，生化上以此作为蛋白质的定量生化上以此作为蛋白质的定量分析方法，称凯氏定氮法。分析方法，称凯氏定氮法。计算公式：计算公式：蛋白质含量蛋白质含量=蛋白氮蛋白氮6.256.25有些蛋白质还含有微量的有些蛋白质还含有微量的P、Fe、Zn、Cu、Mo、I等元素。等元素。1 1、蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成 蛋白质根据其所含化学成分可分为单纯蛋白和缀合蛋白。蛋白质根据其所含化学成分可分为单纯蛋白和缀合蛋白。l单纯蛋白：单纯蛋白：仅由仅由2020种氨基酸组成，而不含其它化学成分的蛋白质，种氨基酸组成，而不含其它化学成分的蛋白质，称称单纯蛋白（单纯蛋白（simple proteinsimple protein）。）。l缀合蛋白：缀合蛋白：除了含有由氨基酸组成的蛋白质部分外，其它各种化学除了含有由氨基酸组成的蛋白质部分外，其它各种化学成分也作为其结构的一部分，这样的蛋白质称为成分也作为其结构的一部分，这样的蛋白质称为缀合蛋白缀合蛋白（conjugated protein conjugated protein ）。）。这些非蛋白部分称为这些非蛋白部分称为 辅基辅基(prosthetic group)(prosthetic group)或或配体配体(ligand)(ligand)。2 2、蛋白质的分类l单纯蛋白单纯蛋白可根据其物理性质如溶解度进行分类可根据其物理性质如溶解度进行分类.例如：清蛋白，球蛋白等。例如：清蛋白，球蛋白等。l缀合蛋白缀合蛋白可以按其非氨基酸成分进行分类可以按其非氨基酸成分进行分类.例如：糖蛋白，脂蛋白，核蛋白等。例如：糖蛋白，脂蛋白，核蛋白等。（二）（二）蛋白质的形状和大小（P P158158）蛋白质根据蛋白质根据形状和溶解度形状和溶解度的不同大体可分为三类的不同大体可分为三类:1 1、纤维状蛋白质（、纤维状蛋白质（fibrous proteinfibrous protein）(形状形状)2 2、球状蛋白质（、球状蛋白质（globular proteinglobular protein）(形状形状)3 3、膜蛋白（、膜蛋白（membrane proteinmembrane protein）(溶解度溶解度)（三）蛋白质构象和 蛋白质结构的组织层次(P P160160)1 1、蛋白质的构象、蛋白质的构象 1 1）构型：构型：指在具有相同结构式的立体异构体中取代基团指在具有相同结构式的立体异构体中取代基团在空间的相对取向，例如，在空间的相对取向，例如，L-AlaL-Ala与与D-AlaD-Ala。不同构型如果。不同构型如果没有共价键的断裂是不能互变的。没有共价键的断裂是不能互变的。2 2）构象构象：具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可：具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态，构象形态的改变不涉及共价键的断裂。能的多种形态，构象形态的改变不涉及共价键的断裂。构型：构型：具有相同结构式具有相同结构式的立体异构体中取代基的立体异构体中取代基团在空间的相对取向。团在空间的相对取向。构象构象：具有相同结构式：具有相同结构式和相同构型的分子在空和相同构型的分子在空间里可能的多种形态。间里可能的多种形态。2 2、蛋白质结构的组织层次蛋白质结构的组织层次 一级结构一级结构（primary structureprimary structure）多肽链中的氨基酸排列顺序。多肽链中的氨基酸排列顺序。二级结构二级结构（secondary structuresecondary structure）多肽链借助氢键排列成自己特有的多肽链借助氢键排列成自己特有的螺旋和螺旋和折叠股折叠股片断。片断。三级结构三级结构（tertiary structuretertiary structure）指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。向的紧密球状构象。四级结构四级结构（quaternary structurequaternary structure）是指寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和是指寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。结合方式。血红蛋白结构的组织层次一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构 多肽链中多肽链中的氨基酸排的氨基酸排列顺序。列顺序。多肽链借多肽链借助氢键排列成助氢键排列成自己特有的自己特有的螺螺旋和旋和折叠股片折叠股片断。断。多肽链借助各多肽链借助各种非共价键弯曲、种非共价键弯曲、折叠成具有特定折叠成具有特定走向的紧密球状走向的紧密球状构象。构象。寡聚蛋白质中各寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上亚基之间在空间上的相互关系和结合的相互关系和结合方式。方式。(四四)蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性（P P160160）蛋白质是构成生命体的主要化学物质。蛋白质是构成生命体的主要化学物质。生生命命活活动动所所需需要要的的许许多多小小分分子子物物质质和和离离子子，它它们们的的运运输输均均由蛋白质来完成。由蛋白质来完成。1 1、催化、催化-酶酶 2、调节-调节蛋白 如胰腺兰氏小岛及-细 胞分泌的胰岛素 3、转运-血红蛋白、血清清蛋白、膜转运蛋白 4、贮存-卵清蛋白、酪蛋白(四四)蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性（P P160160）蛋白质是构成生命体的主要化学物质。蛋白质是构成生命体的主要化学物质。生生命命活活动动所所需需要要的的许许多多小小分分子子物物质质和和离离子子，它它们们的的运运输输均均由蛋白质来完成。由蛋白质来完成。5 5、运动、运动-肌动蛋白，动力蛋白肌动蛋白，动力蛋白6 6、结构成分、结构成分-结构蛋白结构蛋白7 7、支架作用、支架作用-接头蛋白接头蛋白8 8、防御和进攻、防御和进攻-免疫球蛋白免疫球蛋白9 9、异常功能、异常功能-节肢弹性蛋白节肢弹性蛋白 (一）肽和肽键的结构一）肽和肽键的结构（二）肽的物理和化学性质（二）肽的物理和化学性质（三）天然存在的活性肽（三）天然存在的活性肽二二、肽肽（P P163163）CONCHR+H3NCHR COO-H（一一）肽和肽键的结构肽和肽键的结构（P P163163）肽键是一种共价键，它是由两个氨基酸脱水缩合形成的肽键是一种共价键，它是由两个氨基酸脱水缩合形成的,蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连结形成的生物大分子。蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连结形成的生物大分子。英文肽键肽键CONCHR+1H3NCHR COO-1HPeptide Bond Peptide Bond is the covalent（共价）（共价）bond that is formed when 2 amino acids are joined together to form the polymer of protein.中文Peptide(Amide)Bonds Condensation（缩合）（缩合）reactions between the carboxyl group of one amino acid and the amino group of a second amino acid result in C-N bond formation.NH2CCOHOHHNH2CCOHCH3HO+glycineGlyD-alanineAlaPeptide(Amide)BondslCondensation reactions between the carboxyl group of one amino acid and the amino group of a second amino acid result in C-N bond formation.NH2CCOHOHHNH2CCOHCH3HO+-H2OPeptide(Amide)BondslCondensation reactions between the carboxyl group of one amino acid and the amino group of a second amino acid result in C-N bond formation.NH2CCOHHNHCCOHCH3HO肽键肽键l氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为氨基酸通过肽键连接起来的化合物称为肽（肽（peptidepeptide）l由两个氨基酸缩合形成的称由两个氨基酸缩合形成的称二肽二肽，以此类推可形成，以此类推可形成三肽三肽，四肽四肽，许多氨基酸缩合形成，许多氨基酸缩合形成多肽（多肽（poly peptidespoly peptides）l氨基酸之间通过氨基酸之间通过肽键肽键连接形成的链称连接形成的链称肽链肽链。l肽链中有游离氨基的氨基酸一端称肽链中有游离氨基的氨基酸一端称N N端端或或氨基端氨基端；l有游离羧基的氨基酸一端称有游离羧基的氨基酸一端称C C端端或或羧基端羧基端，l肽链中间的氨基酸称肽链中间的氨基酸称氨基酸残基氨基酸残基。（二）（二）肽的物理和化学性质肽的物理和化学性质(P(P165165)肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离，等电点等，但是离，等电点等，但是含有两个或两个以上肽键含有两个或两个以上肽键的肽的肽都有一种特殊的都有一种特殊的双缩脲反应双缩脲反应，而氨基酸则，而氨基酸则无，这一反应可用于肽和蛋白质的定性、定量无，这一反应可用于肽和蛋白质的定性、定量分析。分析。2 2 尿素尿素 双缩脲双缩脲 NaOH+Cu(SONaOH+Cu(SO4 4)紫红色紫红色 (三三)天然存在的活性肽天然存在的活性肽(P(P167167)1 1、催产素和加压素、催产素和加压素 2 2、抗生素、抗生素3 3、脑啡肽、脑啡肽 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)(Tyr-Gly-Gly-Phe-Met)4 4、某些蕈产生的毒素某些蕈产生的毒素（环形八肽,P P168168）5 5、谷胱甘肽（、谷胱甘肽（GSH,GSH,P P168168 ）6 6、鹅肌肽和肌肽、鹅肌肽和肌肽(二肽二肽)-鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱（环形八肽,P168）谷胱甘肽谷胱甘肽还原型还原型氧化型氧化型2GSHGSSGOxidation-2H+-2e-+2H +2e-Reduction谷胱甘肽谷胱甘肽2 GluCysGlySHGluGluCysCysGlyGlySS还原型还原型氧化型氧化型-2H+2H还原型还原型 谷谷胱胱甘甘肽肽氧化型氧化型 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽催产素催产素加压素加压素催产素简式催产素简式具有具有催产等催产等作用作用加压素简式加压素简式具有升高血压等作用具有升高血压等作用三三、蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定(P(P168168)(一一)蛋白质一级结构蛋白质一级结构（二）（二）N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定（三）二硫桥的断裂（三）二硫桥的断裂（四）氨基酸组成的分析（四）氨基酸组成的分析（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物分离纯化（五）多肽链的部分裂解和肽段混合物分离纯化三三、蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定l (六六)肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定l (七七)肽段在多肽链中次序的确定肽段在多肽链中次序的确定l (八八)二硫桥位置的确定二硫桥位置的确定l (九九)蛋白质测序举例蛋白质测序举例l (十十)蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库1.氨基酸在蛋白质多肽链中的排列顺序2.肽键是蛋白质一级结构的基本结构键胰岛素的一级结构图胰岛素的一级结构图（二）（二）N N-末端和末端和C C-末端末端 氨基酸残基的鉴定氨基酸残基的鉴定l1 1、N-N-末端分析末端分析 主要方法：主要方法：1 1）2,4-2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB或或FDNBFDNB）法）法 2 2）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（DNSDNS）法）法 3 3）苯异硫氰酸酯（）苯异硫氰酸酯（PITCPITC）法）法 4 4）氨肽酶法）氨肽酶法2 2、C-C-末端分析法末端分析法主要方法：主要方法：1 1）肼解法）肼解法 2 2）还原法）还原法 3 3）羧肽酶法）羧肽酶法肼解法肼解法l肼解法：肼解法：这是测定这是测定C-C-末端最常用的方法。将多肽溶末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，于无水肼中，100100下进行反应，结果羧基末下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。分与肼生成氨基酸肼。NH2CHCO-(NHCHCO)n-NHCHCOOH +NH2NH2RRR(n-1)NH2CHCO-NHNH2 +NH2CHCOOHRR多肽多肽肼肼各种氨基酸肼各种氨基酸肼羧基末端氨羧基末端氨基酸基酸无水无水（三）（三）二硫桥的断裂二硫桥的断裂断裂二硫桥的方法有多种，但归结起来主要有两种：断裂二硫桥的方法有多种，但归结起来主要有两种：1 1、氧化法：常用试剂为过甲酸。、氧化法：常用试剂为过甲酸。2 2、还原法：常用试剂为巯基化合物，如巯基乙醇。、还原法：常用试剂为巯基化合物，如巯基乙醇。（四）（四）氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析l待样品完全水解，用氨基酸分析仪进行测定。待样品完全水解，用氨基酸分析仪进行测定。l用于蛋白质的氨基酸组成分析的水解方法主要是用于蛋白质的氨基酸组成分析的水解方法主要是酸酸水解水解，碱水解碱水解，酶水解酶水解。（1 1）酸水解酸水解常用常用HCl HCl 或或H H2 2SOSO4 4进行水解。进行水解。方法：方法：一般用一般用6mol/L HCl6mol/L HCl，或，或4mol/L H4mol/L H2 2SOSO4 4，105105o oC C 回流煮沸回流煮沸24h24h左右可使蛋白质完全水解。左右可使蛋白质完全水解。优点：优点：不引起消旋作用，得到的是不引起消旋作用，得到的是L-L-氨基酸。氨基酸。缺点：缺点：色氨酸完全被沸酸所破坏。羟基氨基酸有一小部分被分色氨酸完全被沸酸所破坏。羟基氨基酸有一小部分被分解，天冬酰氨，谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。解，天冬酰氨，谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。（2 2）碱水解碱水解 方法：方法：一般与一般与5mol/L NaOH5mol/L NaOH共煮共煮10-20h10-20h，即可使蛋白质完全水解。，即可使蛋白质完全水解。优点：优点：色氨酸在碱性条件下稳定。色氨酸在碱性条件下稳定。缺点：缺点：水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生产生消旋现象消旋现象，所得的产物是，所得的产物是D-D-和和L-L-氨基酸的混合物，称消旋氨基酸的混合物，称消旋物。此外，精氨酸脱氨，生成物。此外，精氨酸脱氨，生成鸟氨酸鸟氨酸(P(P129129)和尿素。和尿素。（3）酶水解酶水解优点：优点：不产生消旋现象，也不破坏氨基酸。不产生消旋现象，也不破坏氨基酸。缺点：缺点：水解不彻底，需几种酶协调作用才能彻底水解蛋白水解不彻底，需几种酶协调作用才能彻底水解蛋白质。质。常用蛋白酶：常用蛋白酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）及胃蛋白酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）及胃蛋白酶等。等。（五）（五）多肽链的部分裂解和多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化肽段混合物的分离纯化裂解时要求：断裂点少，专一性强，反应产率高。裂解时要求：断裂点少，专一性强，反应产率高。1 1、酶裂解法、酶裂解法 （1 1）胰蛋白酶（）胰蛋白酶（trypsintrypsin）（2 2）胰凝乳蛋白酶（）胰凝乳蛋白酶（chymotrypsinchymotrypsin）l2 2、化学裂解法、化学裂解法 主要用溴化氰断裂主要用溴化氰断裂NHCHCOR1NHCHCOR2当当R R1 1为甲硫氨酸时，可用溴化氰断裂为甲硫氨酸时，可用溴化氰断裂裂解后，分离各不同肽段。裂解后，分离各不同肽段。（六六）肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定 主要使用主要使用EdmanEdman化学降解法，此外还有酶降化学降解法，此外还有酶降解法、质谱法和气谱解法、质谱法和气谱-质谱联用法等。质谱联用法等。(七七)肽段在多肽链中次序的确定肽段在多肽链中次序的确定 一级结构的测定多半用小片段重叠的原理，一级结构的测定多半用小片段重叠的原理，即用两种或两种以上不同的方法将蛋白质多肽即用两种或两种以上不同的方法将蛋白质多肽链水解，各自得到一系列肽段，然后将这些肽链水解，各自得到一系列肽段，然后将这些肽段分离纯化，分别测定这些肽段的氨基酸序列，段分离纯化，分别测定这些肽段的氨基酸序列，最后比较这些肽段之间的重叠关系，从而推出最后比较这些肽段之间的重叠关系，从而推出整个蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。整个蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。（见例见例题）题）例例1 Thr-Asp-Phe-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys l例例2 2：一个九肽，用胰酶水解得：一个九肽，用胰酶水解得：Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Ala-Ala-Trp-Gly-Lys （A A）Thr-Asp-Phe-Lys Thr-Asp-Phe-Lys （B B）用胰凝乳蛋白酶水解得：用胰凝乳蛋白酶水解得：Lys-Ala-Ala-Trp Lys-Ala-Ala-Trp （1 1）Thr-Asp-Phe Thr-Asp-Phe （2 2）Gly-Lys Gly-Lys （3 3）由以上两套水解方案可知该九肽的氨基酸顺序为：由以上两套水解方案可知该九肽的氨基酸顺序为：(八八)二硫桥位置的确定二硫桥位置的确定 一般采用胃蛋白酶水解原来含有二硫键一般采用胃蛋白酶水解原来含有二硫键的蛋白质，得到的蛋白质，得到“工工”字肽，然后将字肽，然后将“工工”字字肽片断的二硫键打开，测定其氨基酸顺序，再肽片断的二硫键打开，测定其氨基酸顺序，再与测定好的原多肽链的氨基酸顺序进行对照，与测定好的原多肽链的氨基酸顺序进行对照，确定二硫键的位置。确定二硫键的位置。ss四四、蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 与生物功能与生物功能(P(P181181)(一一)同源蛋白质的物种差异与生物进化同源蛋白质的物种差异与生物进化 (二二)同源蛋白质具有共同的进化起源同源蛋白质具有共同的进化起源 (三三)血液凝固与氨基酸序列的局部断裂血液凝固与氨基酸序列的局部断裂 同源蛋白质的同源蛋白质的 物种差异与生物进化物种差异与生物进化 1 1、同源蛋白质、同源蛋白质 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质，例如各种脊椎动物中的氧转运蛋白源蛋白质，例如各种脊椎动物中的氧转运蛋白血红蛋血红蛋白白。同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链，而且同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链，而且它们的氨基酸序列有许多位置都是相同不变的。它们的氨基酸序列有许多位置都是相同不变的。血红蛋白2 2、细胞色素细胞色素C 细胞色素细胞色素C C是一种含是一种含血红素血红素的的电子转运蛋白电子转运蛋白，是呼吸链中的组成，是呼吸链中的组成成员之一，它存在于所有真核生物成员之一，它存在于所有真核生物的线粒体中。的线粒体中。细胞色素细胞色素C C的研究提的研究提供了同源性的最好例子。供了同源性的最好例子。血红素血红素结构见结构见P P254.254.血红素血红素 细胞色素细胞色素C C由由一百零几个氨基一百零几个氨基酸构成，酸构成，4040多个多个物种细胞色素物种细胞色素C C分析表明，多肽分析表明，多肽链中有链中有2828个位置个位置上氨基酸是相同上氨基酸是相同不变的不变的。血红素血红素弯曲或回转弯曲或回转螺旋螺旋3 3、系统树系统树 细胞色素细胞色素C C 的氨基酸序列资料已被用来核对各的氨基酸序列资料已被用来核对各个物种之间的分类学关系以及绘制系统个物种之间的分类学关系以及绘制系统 发生发生 树或树或称进化树。称进化树。根据系统树不仅可以研究从单细胞生物到多细根据系统树不仅可以研究从单细胞生物到多细胞生物的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的胞生物的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类物种的分歧时间。各类物种的分歧时间。不不同同生生物物细细胞胞色色素素C C分分类类系系统统树树P183图图4-17 分支线上的数字表示物种和潜在分支线上的数字表示物种和潜在（假设）的祖先之间的氨基酸变化（假设）的祖先之间的氨基酸变化 五五、肽与蛋白质的人工合成肽与蛋白质的人工合成(P(P189189)l （一）肽的人工合成（一）肽的人工合成l （二）胰岛素的人工合成（二）胰岛素的人工合成l （三）固相肽合成（三）固相肽合成双缩脲的结构式和反应式CONH2NH2CONH2NH2CONHNH2CONH2+NH3加热加热