血清总蛋白测定(双缩脲试剂法).pdf

生物化学实验报告生物化学实验报告姓姓名：名：学学号：号：专业年级：专业年级：组组别：别：生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称实验名称血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）实验地点实验地点指导老师指导老师教师签名教师签名第五实验室第五实验室实验日期实验日期2014-11-212014-11-21合作者合作者评分评分批改日期批改日期一、实验目的一、实验目的1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；2、熟悉血清总蛋白的临床意义；3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。二、实验原理二、实验原理（一）（一）：双缩脲反应：双缩脲反应在碱性溶液中,双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与 Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合 物,这 个 反 应 叫 做 双 缩 脲 反 应。两 分 子 尿 素 加 热 脱 氨 缩 合 成 的 双 缩 脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与 Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与 Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在 540nm 处的吸光度与蛋白质的含量在 10120g/L 范围内有良好的线性关系。三、材料与方法：三、材料与方法：实验材料实验材料样品：大牛血清试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（%）器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球设备：1100 分光光度计、水浴锅实验步骤实验步骤取 3 支试管，做好标记(B 空白对照，S 标准液，U 为待测大牛血清)，按下表操作：加入物（ml）大牛血清（1：10）蛋白标准液（1：10）%氯化钠溶液双缩脲试剂a.各管混匀，观察各试管颜色b.将各试管置于 37水浴锅中加热 20min，观察颜色c.将试管中的液体倒入比色杯中，置于 1100 分光光度计的样品槽内，在波长 540nm，以空白管调零，测 S 和 U 管吸的光度。d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管B(空白）-S（标准）-U（待测）-依据公式算出结果四、结果与讨论：四、结果与讨论：（一）：实验结果（一）：实验结果1、实验现象：a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；b、水浴 20 分钟之后，B 试管试管显淡蓝色；S 试管和 U 试管显浅紫色且 S 试管的颜色比 U 试管的颜色稍深。2、实验数据：管号测定次数平均吸光度 1 2 3 S U3、结果计算：将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X 蛋白质标准液浓度（g/L),得出结果：血清总蛋白=L（二）：结果讨论（二）：结果讨论查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下：1、成功的方面：a.在本次试验出现了预期的结果：S 和 U 试管溶液显淡紫色，B 试管显淡蓝色。S 和 U试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅，B 试管显浅蓝色的原因是 B 试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。b.水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。2、误差分析：a.所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低b.待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏低c.操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大五：结论五：结论样品的蛋白质含量偏低复习思考题1.什么叫双缩脲试剂为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾双缩脲试剂2.试剂配制过程中，为何 NaOH 要单独配制，最后加入3.简述血清总蛋白测定的临床意义。