2023年分子诊断知识点.docx

I、基因（gene）是具有生物信息的DNA功能片段,根据这些生物信息可以编码具有生 物 功能的产物，涉及RNA和蛋白质（多数）.2、 基因组genome,指细胞或生物体一套完整的遗传物质，涉及所有基因和基因间的 区域（序列）。3、基因组学genomics以基因组为研究对象的一门学科，涉及基因组作图、基因组测序、 基因定位、基因功能分析4、结构基因：编码RNA或蛋白质的核甘酸序列5、基因表达：DNA携带遗传信息通过转录传递给RNA, m RNA通过翻译将基因的遗传 信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程6、C值基因组 DNA 所有碱基（对）数。C值是物种的一个重要特性常数。C值矛 盾，C值悖论：生物体的进化限度与基因组大小之间不完全成比例的现象7、N值矛盾，N 值悖论:基因组中的基因数目与生物进化限度或复杂限度的不对称性8、必需基因（致死基因）关系到生物体存活的基因。可通过基因突变实验拟定必需基 因。：9、原核生物基因组1、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等1 0、重叠基因:是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序歹人或是指一段DN A 序 列为两个或两个以上基因的组成部分。11、操纵了：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同组成一个转录单位12、质粒的分类致育质粒F质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒 R质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒Vi质粒）编码与该 菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒编码细菌产生细菌素； 代谢质粒 编码产生相关 的代谢酶。13、 严紧控制型拷贝数少，一般10个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染 色体DNA复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝因素），认为是该质粒可以产生阻遏蛋 白，反馈克制自身DNA合成。松弛控制型拷贝数多，10-20（）个，分子量小；调节因子是RNA,复制不受染色体DNA复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数）质粒，以获核酸分离与纯化：1、鉴定完整性:以澳化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判断核 酸完整性1、完整无降解或降解很少的总RNA电泳图，除具特性性三条带外，三条带的 荧光强度应为一特定比值2、降解系数大的核酸条带相对分子质量大，电泳迁移率低，澳 化乙锭嵌入核酸中的数量也增多，荧光强度高;反之3、一般28s或23SRNA的荧光 强度约为18S或16s的2倍，否则提醒有RNA降解，若在加样槽附近有条带，则DN A有污染 2、真核生物RNA18S、2 8s原核：2 3S、16s 3、mR N A代表基因转录水 平，行使模版功能4、核酸纯度鉴定：1、紫外分光光度法：最常用 A：核酸在2 60nm 处有最大吸取峰B:蛋白质在280nm处C：盐和小分子在2 3 OnmD：酚在2 70nm处5、纯 DNA A 2 6 0/A 2 8 0 =1.8 A 260/A 280= 2 .0 高质量 RNA( 1 . 8-2. 1 ) A230 / A 2 若升高，有残余盐2、荧光光度法PCR 1、P CR聚合酶链反映技术的原理:由人为提供模板DNA、DNA引物、4种d NTP 和DNA聚合酶，在体外条件下实现DNA复制的过程。2、PCR用途：目的基因克隆、基因体外突变、DNA和RNA的微量分析、DNA序列测 定、基因突变分析3、PCR三个基本环节：变性-退火-延伸变性：93-98摄氏度退火： 37-65摄延伸: 7 0-75摄,，整个PC R过程一般需进行三十轮的循环，4、退火温度由引物的Tm 值决定，延伸温度和时间由TaqDNA 酶活性决定一般变性 温度与时间为9 4 3050 s产物由引物决定，循环次数由初始模版浓度决定5、变性:在第一轮循环前需预变性，在94c下变性5-I()min非常重要，它可使模板DNA 完全解链；退火:引物退火的温度的高低和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物 的长度、引物与模板的配对限度以及引物的浓度实际使用的退火温度比扩增引物的Tm 值约低5退火温 度越高，所得产物的特异性越高延伸:反映通常为72,接近于Ta q DNA聚合酶的最适反映温度75 6、Tm 值:DNA热变性发生在一个很窄的温度范围内，将DNA变性达成 5 0 %时的 温度称解链温度或溶解温度。GC越高，Tm值越高 7、标准的PCR反映体系模板DNA0.12 ug引物各0. 1 1 .0 u m o 1/L 4种dNTP混 合物 各 20 0 umol/L Taq DNA 聚合酶 2.5 u Mg2+1. 5 2. 0 mmol/L8、产物不同:1、长片段产物 以算术倍数增长在终产物中忽略不计2、短:长度严 格定格在两引物5 *端之间，是需要扩增的特异片段以指数倍数增长以上是PCR产物 不需纯化的因素9、产物不同因素：引物结合的模版不同10、引物：事实上就是两段与待扩增靶DNA 序列3侧，互补的寡核昔酸片段。扩 增时从引物的3'端开始，以5' - 3'方向延伸，两引物的5'端决定扩增产物的两个 5 末端位置，两引物间距离决定扩增片段的长度。II、引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的12、引物设计有3条基本原则:1、引物与模板的序列要紧密互补；2、引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反映 （即错配）13、PCR扩增产物的检测方法：1.凝胶电泳重要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电 泳琼最常用最经典可判断产物大小2、限制性内切酶酶切分析RFLP若知道PCR 扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制性内切酶消化PCR产物， 再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可鉴定PCR产物的特异性及是否存在 突变。用于检测基因突变3、分子杂交 为了拟定PCR产物是否是预先设计的目的片 段或产物是否有突变点杂交、Sou t hern印迹杂交点杂交灵敏度较高,特别合用于特 异性不 高的PCR扩增产物分析。用于检测基因突变，常规的southern印迹杂交可 鉴定PCR产物的大小和特异性4、酶检测PCR法一方面对PC R反映的引物5 '端进行 修饰，一个引物的5'端携带便于PCR产物固定的功能基因，如生物素等,另一个引物的 5'端具有便于酶联显色检测的基团，如酸或抗原、抗体等。通过包被于微孔板中的基团 如亲和素，将PCR产物固定于微孔板上，进行酶联显色，比色测定 合用于检测引物5' 端修饰的PCR产物 比电泳检 测灵敏度高,比分子杂交法简便。5、测序PCR产物直接 进行测序分析可检测基因突变是检测其特异性的最可靠方法 14、RFLP限制性内切能酶切分析：由于基因突变导致某一限制性内切酶的酷切位点序 列产生或消失，经电泳分离出大小不同的片段。15、提高PCR的特异性和敏感性I.热启动PC R：一种在冰上配制PCR反映液，并将其置 于预热的PCR仪,通过克制一种基本成分延迟 DNA合成，直到PCR仪达成变性温 度。2、梯度PCR：复性温度高低决定扩增的特异性产物高低选定一个复性温度范 围， 跨越引物Tm值1020。初期循环，复性时从高温开始，逐渐减少复性温度，直至最 低复性温度3、巢式PCR ( nested PCR)嵌套式PCR：用2对引物进行2次PCR 来扩增目的基因第一次PCR： 一对外侧引物第二次PCR：一对内侧引物4、免疫PCR： 酶检测PCR法通过免疫酶反映+ PCR来进一步提高敏感性和特异性16、多重PCR:它是在同一 PCR反映体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片 段的PCR反映,其反映原理，反映试剂和操作过程与一般PCR相同17、不对称 PCR ：目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法:采用两种不同浓度的 引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0. 01 ： 0. 5M,关键是 限制性引物的绝对量。用途:制备核酸序列测定的模板、制备杂交探针、基因组 DNA结 构功能的研究18、反向PCR:目的：在于扩增一段已知序列旁侧未知 DNA序列19、任意引物PCR： AP-PCR区分不同种的菌株、种内不同血清型、血清型内不同 亚型。作用：判断相同种的不同分离株是否有流行病学上的相关性2 0、重组PCR:运用PCR技术，使两个不相邻的DNA片段重组在一起的方法，称重 组PCR目的：使2个不同来源的DN A片段重组；构建基因突变体如点突 变、缺失、插入等。21、反转录PCR (RT-PCR):RNA分子为模板进行的扩增，以其一方面要进行反转录 产生cDNA, 然后进行常规的PCR反映关键环节是RNA反转录为cDNA, cDN A 进行PCR与一般 由PCR无差别。22、荧光定量PCR(FQ-PCR)又称实时PCR(RT-PCR):非探针类PCR,通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并精确地计算出PCR的初始模板量 23、荧光定量 PCR技术在HBV 检测中的应用：HB V感染的初期诊断、监测治疗 效果、判断病情,指导制定合理的治疗方案、在乙肝病毒耐药性检测中的应用、血液制品和 鲜血员的筛选,隐匿性肝炎的发现、HBV-DNA定量有助于指导怀孕，减少宫内感染的 发生率、筛选肝炎的质量药物24、水解探针:Ta q man探针:PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光 探针。该探针为一直线型的寡核甘酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基 团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸取，PCR仪检测不到荧光信 号，PCR扩增时（在延伸阶段）T叫酶的5'- 3'外切酶活性将探针酶切降解，使 报告荧光基团，和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号25、Beacon技术:即分子灯塔法或分子信标技术：单链寡核甘酸荧光探针，在无靶序列的 情况下，探针始终是发卡结构，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到 荧光信号;而在有靶序列时，即在PCR的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和 猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。26、FRET技术：基本原理是:两条直线型春核苜酸探针，其中一条的3 '端标记荧光激发基 团，另一条的5 '端标记荧光检测基团，在无靶序列的情况下，两条探针分开，无法进行 能量的传递，这样荧光仪不能检测到荧光信号，当有靶序列时，即在PCR的退火阶段两条 探针与靶序列结合，使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递，这样荧光仪就可以 检测到荧光信号，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。所以对该信号的检测是在退火后 进行7. Sang er定义：以靶DNA链为模板，指导核酸合成的过程中，以释放荧光为检测 信号，从而对靶 DNA链进行实时测序的方法原理:运用DNA聚合酶，以单链 DNA为 模板，以dN TP为底物，在四组相对独立的反映体系中分别加入不同的ddNTP作为链反映 终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序梯度的互补DNA 链，然 后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射日显影检测后直接识度待测DNA 的序列28、如何来拟定模板DNA的量？当固定C循环数后,荧光信号与模板数成正比；当固定 t荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多,Ct值越小运用已知起始拷贝数的标准品可作出标准 曲线，其中横坐标代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标代Ct值只要获得未知样品的Ct值, 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。29、Ct值的含义是：每个反映管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值 分析事实上就是低浓度的荧光值分析0、荧光域值：是指PC R反映的前15个循环的荧光信号3 1、RNA的体外扩增NASBA：核酸序列的扩增NASBA、转录依赖的扩增系统TA S、自主维持序列扩增或再生式序列复制3SR32、基本原理:以RNA为模板在体外大量扩增 RNA,运用3种酶:逆转录酶、T7RNA聚 合酶和RNaseH,模拟逆转录病毒RNA genome的复制过程，来大量扩增RNA。反 映体系温 度均一 at 4 2、RNA产物以10的指数方式增长33、2个特殊引物:引物A与RNA3'端互补，5 '端含T7启动子引物 B与cD NA 第一条链3'端互补3 4、连接酶链反映LCR基本原理：是以DNA连接酶将某一 DNA链的5'磷酸与另一 相邻链的3'翔基连接为基础的循环反映。1、遗传性疾病的分子诊断策略和方法？遗传性疾病分两类:符合孟德尔遗传规律的单基因 遗传病、不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（又称多因素性疾病）2、三代遗传标志 1.RFLP2.ST R,VNTR3.SNP2、遗传病的分子诊断：1、血红蛋白病:血红蛋白病可以分为由于珠蛋白一级结构的变化 所导致的异常血红蛋白病；由于珠蛋白多肽链的合成速率不平衡所导致的地中海贫血 2、镰状细胞贫血:一种遗传性贫血症，属隐性遗传性疾病。患者的红细胞缺氧时变成镰刀 形，失去输氧的功能,破裂导致严重贫血。该病常见于非洲和美洲黑人，由于杂合基因型细 胞贫血症状轻微，但红血球内的轻微缺氧对寄生在红血球里的疟原虫却是致死的，有助于 防止疟 疾的流行 限制性内切酶Mstll辨认序列为CCTNAGG,N为任意核甘酸。因此B 珠蛋白基因的第5、6、7密码子中有该内切的的辨认位点。发生镰状突变后该酹 切位点消失3、地 中海贫血：是由于珠蛋白链的合成不平衡所导致的一类常见的单基因遗传性、溶血 性疾病 A:PCR法、Southern印迹法、B：PCR-RDB法、P CR-ASO 法、等位 基因特异性PCR (ASPCR)、 芯片技术3、产前遗传缺陷的分子诊断:产前诊断 PND、植入前遗传学诊断PGD:PND和PGD 的适应症：PND：(通过对绒毛组织或羊水细胞的基因分析，可诊断100多种单基因 遗传病。PGD:采用极体分析法对3 0多种遗传病进行诊断。)A.有也许孕育出严重遗 传性疾病和先天性畸形胎儿的孕妇。B.夫妇一方有某种遗传病或曾生出过某种遗传病患 儿，或孕妇有X伴性隐 性遗传病家族史。C.夫妇任何一方为染色体异常、染色体平衡移 位和倒位携带者。D.早孕阶段曾服用过致畸药物或曾有病毒感染史等致畸情况。E.羊水 过多或过少。F.因素不明的多次流产、死胎、死产的孕妇。G.胎儿发育迟缓。H.未触到 正常的胎儿。I.年龄超过35岁的孕妇等等4、肿瘤细胞增生的分子机制：原癌基因活化或抑癌基因失活;促凋亡基因失活或克制凋亡 基因功能增强;DNA修复基因失活5、家族性高脂血症的分子诊断表型分类 基因缺陷临床特性家族性高胆固醇血症LDL 受体缺陷胆固醇升高为主，多为冠心病和高脂血症家族史。家族性载脂蛋白B100缺 陷Apo B100缺陷同上家族性混合型高脂血症不清楚胆固醇和甘油三酯均升高， VLDL 和LD L皆增长，有冠心病家族史。 家族性异常B脂蛋白血 Apo E异常胆固 醇和甘油三酯均升高，乳糜微粒、VLDL残粒及IDL明显增长家族性高甘油三酯血症 不清楚甘油三酯升高为主，VLDL明显增长6、多基因疾病:多基因疾病的发生涉及两个以上的基因及其它们之间的互相作用,环境因 素也扮演了重要的角色,疾病的发生没有明显的家系传递性，如肿瘤、糖尿病、高血压、冠 心病、哮喘病、骨质疏松症、神经性疾病、原发性瘢痫等7、常见的单基因病和多基因病名称:1、单:血红蛋白病、肌营养不良症、血友病、茉丙酮酸尿症、Wilso n 病、G6PD 缺少症、2、多：肿瘤、糖尿病、家族性高血脂症、高血 8、如何对一种新发传染病进行分子诊断：对新发传染病人接触的生物、病人外周血、唾 液、痰液等也许具有病原体的物质进行培养，对培养液进行抗原提纯、免疫学检测、通过 提取做RT-PCR解决、DNA 做PCR解决、电泳鉴定及测序，与已知病原体序列作 比对，以发现新发传染病的病原体的科别。9、肿瘤的分子诊断策略:1、检测肿瘤相关基因2、检测肿瘤相关病毒的基因3、检测肿 瘤标志物10、分子诊断在移植配型中的应用：HLA的分子生物学分型移植配型（乂称为HLA配 型/组织配型）:指在器官移植中检查供受者之间移植抗原（HLA）是否相配的一系列措施。目前重要检测的是A RO抗原系统和HLA抗原系统。HLA配型在器官移植中的应用:HLA 抗原系统重要进行HLA-A、HLA-B和HLA-DR三对位点的配型，只有两个个体的 HLA配型完全相同才干进行造血干细胞移植,否则会发生移植排斥反映1 1、分子诊断在法医学鉴定中的应用：1、亲子鉴定：指在对父母和子女之间的亲生关系有 所怀疑时,进行遗传关系方面的检查，以便拟定亲子关系是否存在，又称为亲权鉴定。 2、个体辨认：又称个人同一认定。虽然两者的鉴定目的不同，但使用的方法是同样 的。12、基因芯片和蛋白质芯片的定义和应用：I、基因芯片:DNA芯片、DNA微列阵，将大量 的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上。应用:基因表达分析、DNA 序列测定、寻找新基因、基因突变和多态性的检测、疾病诊断、药物筛选、疾病耐药性研 究及检测、个体化医疗检测2、蛋白质芯片:将各种蛋白质有序地固定在滴定板、滤膜、载 玻片等各种载体上成为检查用的芯片，然后用荧光素标记蛋白质或其他成分与芯片作用, 经漂洗后用荧光扫描仪或激光共聚焦技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度 分析蛋白质与蛋白质之间互相作用的关系，由此达成测定各种蛋白质功能的目的。应用：感 染性疾病检测、确诊，肿瘤标记物诊断，药物靶点筛选，构建蛋白质表达谱，进行抗原抗体 筛选，蛋白质蛋白质互相作用等13、生物芯片分类：基因芯片、 蛋白质芯片、芯片实验室基因芯片的技术原理:是指将 许多特定的寡核甘酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/ RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行 杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光 信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片制备流程：探针的制备：原位 合成、合成点样生物芯片的制作、样品解决、杂交或反映、杂交检测及数据解决等14、缩微芯片实验室：将生命科学领域中许多不连续的分析过程，如样品制备、核酸标 记、生化反映、分离检测、数据解决等，通过采用半导体光刻加工等缩微技术，集成到块 生物芯片所形成的一种便携式生物化学分析系统得较多的基因产物。14、质粒性质1、质粒的转移:可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细 胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染 色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。2、质粒具有选择性标记:质粒有抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属盐基因等多种 选择性标记3、质粒的不相容性:质粒已成为分子克隆的有用工具,是目的DNA的载体。载体质粒大 多是在天然质粒基础上经人工构建而成，15、质粒特点：1、有限制性核酸内切的单一切口，可用以重组外源 DNA： 2、有筛选标 记，如抗药基因等；3、插入外源DNA后,仍能转化宿主细胞，并能复制。16、质粒基因转移的方式1.接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛互相接触时，质粒 DN从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用2.转化作用通 过自动获取或人为地供应外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为 转化作用3、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另（受体）细 胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用4、转染作 用 通过感染方式将外来 DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为 转染（trans f ecti o n）。转染是转化的一种特殊形式。17、完整的病毒颗粒涉及：衣壳、基因组（DNA或RNA）、被膜、病毒颗粒中的其 他内容物18、病毒分段基因组:流感病毒属分段RNA 病毒：意义：a ）减少包装压力b）减少了 造 成断裂的也许性,提高编码能力c）有分段基因组的病毒一般感染效率较低，只有所有基 因组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。植物病毒d）由于分段基因组易发生重组，故病 毒容易变异。19、病毒基因组特点：1、有特殊的末端序列:粘性末段、反向互补序列、长 末端反复序列、帽和尾结构等；2、结构紧密，体现在不仅非编码序列少，并且有重叠基 因的存在；真核生物2 0、染色体的包装：（1）染色体的一级结构一核小体（2）染色体的二级结构一螺线管3） 染色体的三级结构一超螺线管（4 ）染色体的四级结构一染色单体21、真核生物染色体基因组一般特性1、真核生物的基因组比较庞大；2、线性双链DNA 和二倍体;3、真核细胞基因转录产物为单顺反子。4、存在反兔序列，反复次数可达百 万次 以上5、基因是不连续的（断裂基因）22、单顺反子l个结构基因通过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一种蛋白质；23、反复序列:指多拷贝的相同或近似序列的DNA片段高度反复序列：按其结构特点分为 三种：1、反向反复序列2、卫星DNA由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用 等密度梯度离心法将其与主体DNA分开,因而称为卫星DNA （或随体DNA） 3、较复杂 的反复单位组成的反复顺序中度反复顺序：依据反复顺序的长度，中度反复顺序可分为: 短散布元件和长散布元件Alu家族是哺乳动物基因组中含量最丰富的一种中度反复顺序家 族（短分散元件），Alu家族每个 成员的长度约300 bp,每个单位长度中有一个 限制性 内切酶Alul的切点（AGICT） ,A 1 u可将其切成长130和170bp的两段，因而 定名为 Alu序列（或 Alu家族）24、断裂基因（split g e ne）：真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区相间隔但 乂连续镶嵌而成，为一连续的氨基酸组成的完整的蛋白质编码，或为具有特殊功能的tRN A或rRN A编码,因此称为断裂基因。 并非真核生物所有的结构基因均为splitt i n g gene例：组蛋白基因家族、干扰素、酵母中多数基因2 5、线粒体DNA的遗传特性：母系遗传、突变率高、异质性、阈值效应、半自助复制 与协同效应26、阈值效应：mt DNA突变导致氧化磷酸化水平减少，当突变的ml DNA 达成一定比例 时，使得线粒体总的能量供应减少到维持组织正常功能所需能量的最低值时，才也许引起某 组织或器官的功能异常而出现临床症状。27、DNA分子多态性的重要方式：微卫星DNA 多态性（同一位点不同个体之间有不同 长度的微卫星DNA）、单个核昔酸的变异一单核昔酸多态性（SNP）等 28、STR结构：微卫星D NA又称短串联反复STR,指以1-6个碱基为核心单位串联重 复而成的一类序列。微卫星DNA结构序列由中间的核心区（反复序列）和外围的侧翼区 （非反更序列）组成，其核心序列为16bp,为高度反生序列。成因：1 .姊妹染色单体的 不均等互换2.复制滑移29、SNP： SNP是基因组中散在的单个核甘酸的变异形成的一种DNA分子多态性位置: 编码区SNP cSNP）、基因周边区SNPpSNP ）基因间SNPiSNP） SNP非编、码 区：SNP编码区=5:1成因:单个核甘酸（碱基）置换：转换：喀咤一嗓皖，喋 吟一 嗯吟；颠换：嘴咤一喋吟，噪吟一喀咤转换:颠换=3:1。蛋白质组1、蛋白质组：生物体的全套蛋白质；或一个生命单位的全套蛋白质2、蛋白质组特性:与基因组相比，蛋白质组有高度动态性:有组织特异性、生长发育特异 性、生理病理状态特异性。3、研究的必要性：1、蛋白质的数量比基因的数量多（转录、翻译、翻译后水平的调控）2、基因组是静态的，蛋白质组是动态的3、蛋白质之间及其与其它各种大、小分子之间的 广泛作用形成的如同网络状的复杂系统。4、蛋白质组学是研究生物体全套蛋白质的组成、结构与功能的科学5、蛋白质的分离：双向凝胶电泳及图像分析技术1、双向凝胶电泳2-DE：第历来的固相pH梯度等电聚焦电泳I PG-IEF第二向SDS-PAGE组成的分离系统：电泳速度 只与蛋白质分子质量有关。原理:等电聚焦电泳:基于蛋白质等电点（PI）的差异进行分离； 聚丙烯酰胺凝胶电泳:是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离6、质谱技术MS：（用于蛋白质的鉴定）是在高真空系统中样品分子离子化后，根据不同 离子间质荷比差异，以拟定样品相对分子质量及分子结构的技术。7、质谱：化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质 荷比大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。8、质谱仪的组成：离子源、质量分 析器、检测器核酸分子杂交1、核酸变性：在理化因素作用下，维系DNA二级结构的氢键和碱基堆积力遭到破坏， DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发 生改变2、核酸复性:变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过 程，称复性或杂交。3、分子杂交:不同来源的核酸变性后，合并在起，只要这些核酸分子具有可以形成碱基 互补配对的序列，复性也会发生在不同来源的核酸链之间，形成杂化双链4、分子杂交技术:用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列, 通过核昔酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列 的位置或大小显示出来的技术。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未 克隆化的基因组DNA和组织细胞的 DNA、RNA。5、核酸探针:指能与特定核酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的、带 有标记的、并已知碱基序列的核酸片段。6、原位杂交:以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂 交并对其检测的方法7、寡核甘酸探针的特点及设计原则?特点：（1）根据需要来合成相应的核酸序列，避免 了天然探针的缺陷；（2）大多数寡核甘酸探针长度较短,一般为1 05 0bp,其序歹U复杂度 低，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短；（3 ）寡核甘酸探针特别适合点突 变的检测（短探针中碱基的错配能大幅度地减少杂交体的Tm值）；（4）探针的长度较 短，特异性较低,杂交信号较弱。设计原则：（1）探针长度:一般规定在105 Obp; （2） G / C含量为4 0 %60%; （3）探针分子中应避免互补序列；（4）避免同一碱基连续出现， 一般不能多 于4个；（5）探针与非靶基因序列的同源性不能超过70%或 8个以上连续 的碱基同源。8、一个抱负的探针标记物应具有的特性？1、灵敏度高2、标记物与探针结合后，应不影响杂交反映，特别是杂交特异性、稳定性和Tm值 3、标记物对检测方法无干扰4、检测 方法要灵敏、特异、稳定、简便5、标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。9、S o u t h ern印迹杂交的基本环节？其毛细管转膜的原理?So u ther n印迹指将电泳分离 的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。基本环节：1、基因组DNA经限制酶 消化后 进行琼脂糖凝胶电泳2、将具有DNA片段的凝胶放入变性溶液使DNA变性3、 将固体支持物放在凝胶上，通过毛细管虹吸或电转移将脚上的DN A 片段转移到固体支持 物上，转移过程中，各DNA片段间的相对位置保持不变，然后通过加热使DN A固定于膜上 4、加入探针使之与膜上的DNA杂交5、冲洗掉为杂交的探针，检测杂交信号10、毛细管虹吸印迹法其基本原理是：容器中的转移缓冲液具有高浓度的Na C 1和 柠檬酸钠， 上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜 向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞 留在膜上11、原位杂交时组织和细胞应固定解决，抱负固定液应具有哪些条件？1、保持组织细胞的 形态2、对核酸无抽提，修饰与降解作用3、不改变核酸在组织细胞内的定位4、不阻碍核 酸与探针的杂交过程5、对杂交信号无遮蔽作用6、理化性质稳定12、如何增强组织的通透性和核酸探针的穿透性？组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核 酸蛋白复合体，影响探针的穿透和杂交体的形成；去垢剂和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白 质；控制消化时间,避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落分子克隆（也称基因克隆或D N A克隆）：指按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体DNA重组，然后 导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝的技术。又 称重组DNA技术1、制备目的基因重要有哪几种方法？直接分离、人工合成、构建基因组文库G-文库、构 建cDNA文库C-文库2、载体：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞进行扩 增或表达的运载工具。 载体化学本质为DNA分子。克隆载体：能将外源基因在受体细 胞中复制扩增并产生足够量目的基因的载体称为克隆载体 表达载体：可以携带目的DNA片段进入宿主细胞扩增和表达，获得目的DNA 蛋白质产物的一类DNA分子3、转化(t r a n sformation)以质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的 过程称为转化。转染(t ransfact i on)是指以噬菌体DNA或以它为载体构建的重组子导入受体细胞的过 程称为转染。感染(infect i on)具有感染力的噬菌体将头部重组子导入受体细胞的过程称 为感染.4、重组子：具有重组 DNA分子的转化细胞重组体:不同来源的DNA通 过重组作用所组成的DNA分子重组DNA:不同来源的DNA通过磷酸二酯键连接而重新 组合成新的DNA分子的过程5、G-文库;将某种生物体的所有基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳 性菌落6、C-文库:将某种生物体基因组转录的所有mRNA,经反转录产生cDNA片段，再分别与克 隆载体重组，储存于某种受体菌中7、基因组文库：具有某种生物所有基因随机片段的重组DN A克隆群8感受态细胞:(c ompelen t c e 1 1 )细胞膜结构改变、通透性增长并具有摄取外源DNA 能力的细胞。9、2型限制酶：可以辨认DNA的特异序列，并在辨认位点或其周边切割双链DNA的一 类核酸内切酶。命名:限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名 第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名第四个字母代表宿主菌的株或型若从一 种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表达。 辨认序列特点：具有回文结构的DNA片段切割方式:在对称轴处同时切割DNA的两条 链、在对称轴两侧相类似的位置切割两条链 末端类型:平末端和3*或5*突出的粘性末 端10、DNA连接酶：是一种封闭DNA链上切口的酶 催化反映的化学本质：修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键反映条件:DNA连接晦的反映条件Tr i s-HCl 50_ 1 0 Ommol/L pH7.5 MgC 1 2 lOmmo 1 /L ATP 0.5-lmmo 1 /L DTT 5mmol/L Volume 10-20LT e m p era t ure 4-l5 Time 4-16h作用:可以催化两个互补粘性末端或平末端双链 DNA 分子形成磷酸二酯键，实现 DNA重组。连接多个平头双链DN A分子11、DNA 聚合酶:酶类：1、大肠杆菌DN A聚合酶I 2、T4DNA聚合酷 3、逆 转录酶、4、Ta q DNA聚合酶5、末端脱氧核甘酸转移酶6、大肠埃希菌 DNA聚合 酶IKI enow大片段、7. T7DNA聚合酶:活性：1、大肠杆菌DNA聚合酶I :参 与DNA修复，具5' -3' 核酸聚 合酶活性、3' -5'和5' -3'外切酶活性2、T4 DNA聚合酶：有3' T 的核酸外切酶活性、5' -3'的DNA聚合酶活性。3、逆转 录酶:（1）以单链RNA为模板，催化合成cDNA 单链 从5*末端或3*末端降解 DNA 杂合链中的DNA 以 DNA 为模板，催化合成cDNA双链。4、Taq DNA 聚合酶：有强的5' 3' DNA聚合酶活性、有 5' 3'核酸外切酶活性、无 3' 5'核酸外切酶活性5、末端脱氧核甘酸转移酶：标记DNA的3'OH末端;也可催 化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。活性同3 7、6、5 *-3*聚合酶活性、3 *5*外切酶活性2612、工具酶作用限制酶：辨认和切割双链DNA连接酶 连接两个DNA分子 聚合酶 DNA 聚合、外切酶1聚合外切Ta q DNA聚合酶聚合外切逆转录酶cDN A合成末端 脱氧核昔酸转移酶3*末端聚合碱性磷酸酶切除末端磷酸基T4多核甘酸激酶5*末端磷 酸化核酸晦S1水解单链核酸13、载体筛选原理：通过某些特定方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正 的重组子的过程14载体特点：1、独立夏制2、筛选标志3、较多拷贝数4、多克隆位点5、较高遗传 稳定性1 4、几种常用载体比较克隆容量受体细胞筛选原理质粒载体2 Kb大肠杆菌p UC系 列 蓝白斑筛选pBR3 2 2 双抗生素筛选噬菌体载体大肠杆菌 入噬菌体22Kb蓝 白斑筛选Ml 3噬菌体1Kb蓝白斑筛选 粘粒载体40-5 0Kb大肠杆菌酵母人工染色体 2 00-10 0 0Kb酵母细胞病毒载体动物细胞15、pBR322质粒特点：1、相对分子质 量好,4.363kb2、有一个更制起始点，为松弛复制子3、可用氯霉素扩增其质粒拷贝数 4、有四环素、氨节霉素两个基因5、有24种限制酶的 单一辨认点16、pUC:pUC18/ 1 9质粒载体是由pRR322质粒和M 13噬菌体重组构建而成的双链 DNA克隆载体。pUC是系列质粒载体1 7、pUC质粒结构特点：1） pUC载体较小,全长仅2 6 86 bp；具有更高的拷贝数 2）只保 留了一个药物抗性基因Ampr3）大肠杆菌B半乳糖甘前基因的启动子及其编码 肽链的DNA序列一一LacZ '基因；4 ）有一个多克隆位点区，极有助于克隆外源基 因。16、分子克隆的基本环节分:目的基因的获得（基因文库、逆转录、人工合成、从基因组 分离）、载体的获得切：限制酹切割目的基因和载体，产生平末端或相同的粘性末端；接： 连接酶连接分子间的粘性末端或平末端；转:重组体导入受体细胞,转化或转染;筛:双抗生18、重组体的筛选方法：1、根据遗传表型筛选（抗生素抗性筛选、B-半乳糖苜酶系统筛 选）2、根据重组子结构特性筛选（1、快速裂解菌落并鉴定分子大小2、内切酶酶切图 谱鉴定3、核酸分子杂交筛选4、PC R筛选重组子5、核甘酸序列测定）19、简述如何筛选pUC 载体和目的基因形成的重组体：（1 ）2.6 9kb,保存了 pBR322 质粒的Ampr,转化菌可在氨羊青霉素培养基中存活；（2） LacZ'基因编码B半乳糖 甘酹的一个片段，与宿主细胞编码的缺陷型B-半乳糖苜晦互补成为完整的酹，催化指示 剂底物Xgal形成蓝色产物，菌落呈蓝色；（3） LacZ'基因中有MCS外源基因插入，使 LacZ'基因插入失活，不能表达a-片段， 不能与宿主细胞互补，X-g a 1不能转变为蓝 色，表现白色菌落。1 9、连接DNA片段的方法重要有哪些？粘端连接、平端连接、定向连接、同聚物加尾连 接、人工接头连接20、重组体DNA 导入受体细胞的方法重要有哪些？ 1、CaC12转化法2、电穿孔法 3、磷酸钙共沉淀法4、人噬菌体的转染5、脂质体法6、显微注射法