2023年质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告.docx

质粒D N A的小量提取及D N A琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的可以 自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分 的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及解母菌等生物（多 为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。然而，1984年，在 Stre p t omyces coelic o ler （天蓝色链霉菌）等放线菌以及在Bor r e 1 i a h e r m s ii （赫氏婢疏螺旋体）等原核生物中，又相继发现 线形质粒。天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天 然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于 数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单一到数千都有也许。 有时有些质粒具有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有具有抗四环素基 因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢 能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在 与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载 体。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松弛控制型。 前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不取5微升PC R扩增产物，向其中加入1微升的上样缓冲液，混 匀后用移液器将其加入加样孔，记录样品点样顺序与点样量。4 .电泳接通电泳槽与电泳仪的电源，调节电压120V,当澳酚蓝染料移 动到距凝胶前沿1 -2cm处，停止电泳。5 .观测在紫外灯下观测凝胶，有DNA处应显出橘红色荧光条带。记录电 泳结果。六、实验结果及分析.实验结果：.实验结果观测:上图中从最左边marker开始第6、7为我和与我同组的同学的 点样结果。可看出第6个明显条带亮度要低于旁边的多数条带，但第 7个条带亮度却与旁边的条带相差不多。但这两个均存在很严重的拖带现象。七、实验注意事项1 .加入溶液I I后快速来回颠倒，不要振荡。2 .加入溶液n I后轻轻振荡。3 .吸取上清时切勿吸到中间层。4 .倒胶时把握好胶的温度，不要高于6 0七,否则温度太高会 使凝胶盘变形。5 .胶一定要凝固好才干拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏 点样孔。6 .点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。7 .在用苯酚、氯仿抽提时应用TE缓冲液将原溶液的体积扩大, 一般是2 003 0 0微升，以减少DNA的损失。8 .在加入酚氯仿的环节中，最佳用未高温灭菌的离心管，由于高 温过程中也许使管口变形，使得振荡混匀过程中酚氯仿容易溢出。9 .溶液I I不可冷冻，现用现配。I 0.在加入等量的酚氯仿离心后，离心管内三层物质，从上至下 依次为DNA上清液，蛋白质，酚氯仿。II . 5096的乙醇可溶解DNA,故应当极其注意70%的乙醇是否盖子 完好，否则稀释的乙醇有也许将所获得DN A溶解掉。八、思考题1 .溶液I、II、HI的作用分别是什么？溶液I ：由葡萄糖,EDTA,Tri s C 1组成.葡萄糖的作用是增长溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA；EDTA 的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子，防止D NA酶对质粒分子的降 解作用；Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围.溶液H：由SDS与Na OH组成.SD S的作用是解聚核蛋白并与 蛋白质分子结合使之变性;NaO H(pH>12)的作用是破坏氢键，使DNA 分子变性.溶液III:由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液.能中 和溶液II的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒D NA复性. K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去. 溶液中的染色体DNA也会与蛋白质一SDS形成互相缠绕的大分子物质, 很容易与小分子的质粒DNA分离，此外，高盐溶液也有助于各种沉淀 的形成.2 .为什么加入溶液I I后不要振荡？由于溶液II的作用是细胞裂解液，假如加入I I液后剧烈摇动， 很也许会损坏质粒，导致细菌基因组污染。九、实验结果误差分析及讨论通过本次实验初步学习了碱裂解法提取质粒DNA的方法及操作； 初步掌握了琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。琼脂糖凝胶电泳在遗 传学实验室中是经常用到的一种获得或检测验证目的基因方法，本次 实验的经验经历，为此后的实验之路打下了坚实的基础。在第六部分中的实验结果中可看出：上图中从最左边marker开 始第6、7为我和与我同组的同学的点样结果。可以看出，这两个条带均存在很严重的拖带现象，说明我们在质 粒DNA的提取过程中存在不少失误的地方，导致提取的质粒DNA片段 中存在很多杂质，因此出现了拖带现象。经初步分析也许存在以下几 点因素：加入溶液II后也许有些许晃动，导致小部分质粒被损坏， 产生了许多杂质；同时，可看出第6个明显条带亮度要低于旁边的多数条带，但第 7个条带亮度却与旁边的条带相差不多，因此可以得出第6个条带在 点样时也许由于操作因素，部分样品未进入点样孔中。初步分析认为 是在点样时样品注入速度过快，导致部分样品被冲出点样孔；同时由 于存在不纯熟、手抖的因素，也会导致少部分样品未加进点样孔。在图中同样可看出，还是有部分同学的样品跑出来的效果是不错 的，说明在之前的质粒DNA提取及点样过程中做的还是相称不错的, 因此在实验结束分析过自己的实验结果后，向他们多多请教，学习他 们在实验过程中的一些优秀经验，让自己变得更好。能复制，通常每个细胞内只具有一个或几个质粒分子，如F因子。后 者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝, 一般在20个以上，如C o 1 E1质粒。在使用蛋白质合成克制剂一 氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到克 制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由 本来20多个扩增至1 0 00-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量 可由本来的2%增长至40 5 0沆把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞 中去进行繁殖和表达的工具叫载体。细菌质粒是重组DNA技术中常 用的载体。质粒分子自身是具有复制功能的遗传结构。质粒还带有某 些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及 所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有 用的。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工 构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择 性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的具有多个限制性 内切酶辨认位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使 分子量尽也许减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多 用途的辅助序列，这些用途涉及通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、 产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片 段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个抱负的克隆载体大体应 有下列一些特性:分子量小、多拷贝、松弛控制型;具有多种常用 的限制性内切酶的单切点；(3)能插入较大的外源DNA片段;(4)具有两 个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。对宿主细胞无害。常用的 质粒载体大小一般在Ikb至1 Okb之间，如PBR 3 2 2、PUC系列、 P GEM 系列和 pBlue script(简称 pBS)等。质粒的不兼容性运用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在， 当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分派到子细胞的 过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中 另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失， 因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性。琼脂糖凝胶从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、竣酸基 团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水， 冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大 小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子 筛，常用于凝胶层析和电泳。 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩 下的不含磺酸基团、竣酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状 的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状 结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。 因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析 原理与其他支持物电泳最重要区别是：它兼有“分子筛“和“电泳"的 双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子 物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不 仅取决于净电荷的性质和数量，并且还取决于分子大小，这就大大提 高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太小，对大多数蛋白质来 说其分子筛效应微局限性道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pit不同带有不同电荷，在电场中受力大小 不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的 pH在69之间，离子强度020.05为最适。常用1%的琼脂糖作 为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100 bp的DNA片段，其分 辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂 糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb,运用脉冲电泳，可分离高达1 0 bp的DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DN A分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由 于糖-磷酸骨架在结构上的反复性质，相同数量的双链DNA几乎具有 等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。二、实验目的1 .学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA2 .学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。三、实验原理1 .质粒DNA的小量提取碱裂解法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的 变性与复性的差异达成分离的目的。在强碱性条件下，染色体DN A的氢键断裂,双螺旋结构解开而变 性，质粒DNA大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补 链不会完全分离，彼此互相盘绕，仍会紧密地结合在一起。当将pH 调到中性并有高浓度盐存在时，变性质粒DNA又回复到本来的结构保 存在溶液中，而染色体DNA不能复性，互相缠绕形成不溶性网状结构。 通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子DNA,蛋白质-SDS复合物等一 起沉淀下来而被除去。提取的质粒DNA再用酚、氯仿抽提进一步纯 化。2 . DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定DNA的方法，它简便易行，只需 少量DNAo琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔， 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。DN A分观测琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是运用荧光染料澳乙锭（EB） 染色,EB在紫外灯照射下，发红色荧光，本实验使用G。1 d v i ewo四、实验器材和材料试剂1 .实验材料菌种：含质粒PET2 8a的大肠杆菌2 .实验试剂：(1)溶液I ：50mm o 1/L葡萄糖溶液25mmol/L Tr i s -Cl (p H8. 0)10mm o 1/L EDT A (pH8. 0)(2)溶液 II： 0.4mol/ L Na OH, 2%SDS用前两者等体积混合，需新鲜配制(3)溶液 III：3moi/L 的乙酸钾(pH4. 8 )3moi/L 乙酸钾 60ml冰乙酸1 1.5m 1水28.5ml(4)酚/氯仿试剂：V (酚)：V (氯仿，含1/24异戊醇)=1:1(5 ) TE缓冲液10ininol/L Tris-Cl (pH7. 4-8.0)1 inmo 1 /L EDTA (pH 8.0)(6 ) LB培养基蛋白腺 10g酵母浸出粉5 gNaC 110g溶解在IL水中，调pH至7.2, 12 1。(2高压蒸汽灭菌20mi(7)氮芋青霉素(Amp)：使用浓度为5 0 1 0 0ug/ml(8) pH8.0 TAE 缓冲液(9)凝胶上样缓冲液：0.2%澳酚蓝，50%蔗糖(10)琼脂糖(11) Im g/ml EB 溶液(12) Mar k er(13) PCR扩增特异DNA片段3 .实验器材：(8)微波炉(9 )水平仪(1 0)一次性手套(11)锥形瓶(1 2)量筒(13)tip(1) E p p endorf 管(2)移液器(3)恒温培养箱(4)低温高速离心机(5 )涡旋混合器(6)水平电泳槽(7)紫外检测仪五、实验操作质粒DNA的小量提取1 .菌种培养将含PET 28 a的大肠杆菌接种于LB (含Am p)中，37 C振荡 培养过夜。2 ,质粒提取3 1)取 L 5ml 培养液倒入 E p pend orf 管中，4, 8 OOOrpm, 离心5m i Do4 2)弃上清，使细胞沉淀尽也许干燥。(3)将菌体沉淀悬浮于100 ul溶液I中，用涡旋振荡器振荡1 min, 置冰浴 1 0m i no(4)加2 00ul溶液II,盖紧管口，快速来回颠倒3次，使内容物 充足混合，不要振荡，至冰浴中3min。(5)加150ul溶液II I (冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次并轻 轻振荡混匀，冰浴5min。(6)4, 1 2 023rpm ,离心5mi n ,将上清液移入另一 Ep p end o rf管中。(7)向上清液中加入等体积酚/氯仿(1： 1 )，用涡旋振荡器振荡 1 -2min,4, lOOOOrpm,离心 2 min,将上清液移入另 一 Epp e n dorf 管中。5 8)加入等体积氯仿，反复上面的操作。(9)加入1/10体积的2. 5 moi/L乙酸钠，再加2倍体积的无 水乙醇，混匀后室温放置5 min,4 , 12 0 23rpm,离心15nli n ,弃上清，将Eppe n d o rf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。(10)加1/70%乙醇振荡漂洗沉淀，4 , 1 2 0 23 rpm,离心2mi n，弃上清。(ll)将Eppendorf管倒扣在吸水纸上，使乙醇流尽，空气中干 燥。(12)力口 lOulTE缓冲液，一20七保存。DNA琼脂糖凝胶电泳1 .琼脂糖凝胶的制备称取045g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml TAE缓冲液，保 鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透明取出摇匀，琼脂糖的浓度为 1. 5 %。待琼脂糖凝胶溶液冷却至5(TC,再加入1. 5ul gold vie w, 使其终浓度为0. 5 ug/毫升。2 .凝胶板的制备用制胶器将紫外透光凝胶盘固定好，采用水平仪调整平衡使凝胶 盘位于同一水平面。将适宜的梳子垂直架在凝胶盘内槽的一端，使梳齿距玻璃板之间 尚有0.51mm的距离。将冷到5(TC左右的琼脂糖凝胶，缓缓倒入凝胶盘内槽，厚度适 宜(注意不要有气泡)。3 点样待凝胶凝固后，小心取出梳齿，将凝胶盘放入电泳槽内。加入足够 的TAE电泳缓冲液，使液面略高出凝胶面。