2023年果蝇杂交实验实验报告2.docx

果蝇杂交实验【实验目的】通过实验验证分离规律、自由组合规律、伴性遗传和连锁互换规律,掌握果 蝇杂交的实验技术和基因定位的三点测验方法，在实验中纯熟运用生物记录的方 法对实验数据进行分析。【实验原理】I.果蝇(f r ui t f 1 y)是双翅目(Dipter a )昆虫，属果蝇属(genus Dro sop hila),约有3000多种，我国已发现8 0 0多种。大部分的物种以腐烂 的水果或植物体为食，少部分则只取用真菌，树液或花粉为其食物。以果蝇作为遗 传学研究的材料，运用突变株研究基因和性状之间的关系己近一百年，至今，各 种研究遗传学的工具已达完善的地步,果蝇对今日的遗传学的发展有其不可磨灭 的奉献;从 198 0 年初,Drs. C. Ne s s le i n-Vol h ard 和 E. Weichau s 以果蝇作 为发育生物学的模式动物，运用其完备的遗传研究工具来探讨基因是如何调控动 物体胚胎的发育，也带动了其它模式生物(线虫、斑马鱼、小鼠和拟南芥等)的 研究，且有非常具体的成果。通常用作遗传学实验材料的是黑腹果蝇(Dro s op h ila melano gaster)。用 果蝇作为实验材料有许多优点：饲养容易。在常温下，以玉米粉等作饲料就可以生长,繁殖。生长迅速。十天左右就可完毕一个世代，每个受精的雌蝇可产卵4 0 05 0 0个，因此在短时间内就可获得大量的子代，便于遗传学分析。染色体数少。只有4对。唾腺染色体制作容易。横纹清楚，是细胞学观测的好材料。突变性状多，并且多数是形态突变，便于观测。果蝇的生活史：b bXsnY。灰体直刚毛理论 比值：3实际 数量：42 4 31199比值：3.54黑体直刚毛灰体焦刚毛黑体焦刚毛1:3:11 4 9 435601.25:2.9 7：1反交:P:黑体直刚毛（bbX+X+ X灰体焦刚毛（BBXs11 丫）X BbX+YFl:F2： BBX+X+ BbX+X+ B BX+Xsn BbX+XsnbbX+X snbbX+X+B bX+Y BBX+Y B BXsnYBbX snYbbX+YbbXsnY灰体直刚毛黑体直刚毛灰体焦刚毛里体隹刚毛理论比值：93:3: 1实际数量:5807202317 9 1698比值：8.3 22.8 7：2.5 71x2检查表型合计正灰体直刚毛黑体直刚毛灰体焦刚毛黑体焦刚毛实得数42431494356011991049交6预期数393613 12393613 121 04 96X29 4.84 6 3P(n= 3 )<0.01（差异极显著）反交实得数58 0 72 02 3179 169 81 0299预期数5793.18751 931.0 625193 1 .0 6 25643 . 6 87510299X21 7.4544P ( n=3)<0. 01（差异极显著）3.伴性遗传图谱分析正交反交P:Xw （雌白眼）X X+Y（雄红眼）X+X+（雌红眼）X X'、'Y（雄白眼）11F1 :X+XW（雌红眼）X XWY （雄白眼）X+X“（雌红眼）X X+Y（雄红眼）理论：1：11:1实际：25:16j30：29F2:X+Xw XWXWX+YXWYX + X+ X+XwX+YXWYy叩中叩一中叩雌红眼 雌白眼 雄红眼 雄白眼雌红眼雄红眼雄白眼理论1:1：1：12:1:实际 3 0 6 9:2583:2537 ： 230 751352747965X2检查红眼白眼合计正交F1表型雌雄雌雄实得数25001641预期数20.5002 0.54 1x 21.9 7 56P(n=l)0. 1o.5(>0. 05 )(差异不显著)F2表型雌雄雌雄合计实得数306 925 372583230710 4 96预期数26 242 6 24262 42 6 241 0496X21 17.2880P(n=3)<0.01(差异极显著)反交F1表型雌雄雌雄合计实得数30290059预期数2 9. 52 9. 50059X20 . 0 169P ( n = 1 )0. 50. 95(>0.05)(差异不显著)F2表型雌雄雌雄合计实得数51 3527 4 7-1 9 659847预期数4923.524 6 1 . 752461. 759847X2142.3761P (n= 2)<(). ()1(差异极显著)4.连锁互换定律运用正交数据进行记录可知，表型+ 5 11和亚1口 +个体数目最少，应是双 互换产物，由此可以推论，基因sn 一定位于中间，而三基因的相对顺序是w sn m三点测交结果记录F2表型数量比例曷组发生在基因w-s ns nmwm+ + +38 5 666.25%w sn m3 0 9 8+ + m88115.94%VJw sn +79 2+ sn m71814.08%VVw + +760+ sn +1513.73%VVw + m240总计1 04 9 611 7. 81%19.6 6 %30. 0 2%互换值图距理论值w-m30. 02%+2X 3 . 73%= 3 7.47%3 7. 473 4.6s n m1 9. 66%19. 6615.1w-sn17. 8 1 %17.8 11 9.5并发率1 .0 7干扰-0 .0 7染色体图W17.811 9. 66,33.4理论连锁图VsnIIin1 5.1()1 9.6 o1.34. 6 0.【分析及讨论】1 .分离定律的验证:果蝇的体色是一对独立遗传的常染色体基因。对于这对 基因来说，自身遵守分离定律，且正反交表型比率相同。但是针对实验得到表型 比率来看，相差比较大。单因子适合度测验重要是来验证分离定律。在X?适合 度检查中我们发现，正交的结果P值0.0 5,说明实验得到的数据与理论的数据相 差不大，支持最初的假设。但是对于反交来说,得到的P值0. 01,说明与孟德 尔分离定律相差很大，不可以用基因的回交来说明。2 .自由组合定律的验证：果蝇的体色和刚毛是两对独立遗传的基因，刚毛基因 位于X染色体上。因此,对于这两对基因来说，自身遵守自由组合定律，且F 2正反 交表型比率不同，通过图谱分析，我们得到正交表型比率（灰体直刚毛: 灰体焦刚毛：黑体直刚毛：黑体焦刚毛）分别为3： 3： 1: 1和9:3:3:1。在双因子 x?适合度检查中，正反交的结果P值均0.0 1,与孟德尔自由组合定律相差很大。针对于以上单因子及双因子x2适合度检查发生的现象，我认为重要有以下 两个方面的因素：1）选取的实验方案自身存在问题。这两对基因并不是完全独立遗传，由反 交型的单因子适合度测验可以看出，体色分离比不符合3： 1,也许两个基因存在 于某些有关于性别方面的连锁。2）实验的误差较大。实验操作的不到位以及对果蝇性别、表型特性分辨错 误使结果出现误差。3 .伴性遗传规律：果蝇的眼色是由X染色体控制的遗传性状，其基因仅位 于果蝇的X染色体上。对于这对基因来说,遵守伴性遗传的规律，且正反交个体在 Fl、F 2代上表型比率不同,通过图谱分析，正交个体在F1代产生的雄性个体都是 白眼的。通过x 2适合度测验,正反交的结果F1代P值均0.05,符合伴性遗传规 律，而F2代P值均VO.O 1,不符合伴性遗传规律。分析因素重要是：1）在伴性遗传中，眼色基因并不是独立进行遗传，其会与X染色体上其他 基因发生连锁互换，从而产生表型性状不符合理论比率的情况，甚至在F 2代会 出现白眼雌蝇的性状（按照遗传图谱分析,F 2代不会出现该性状）。2）实验的误差较大。实验操作的不到位以及对果蝇性别、表型特性分辨错 误使结果出现误差。4 .连锁互换定律的验证：由以上分析数据可以看出，本组实验结果与理论值较为接近,特别是sn-m 基因间的图距。产生数据偏差的因素也许是进行实验的环境条件有差异，我们知 道不同环境条件下的重组值是有变化的。并且进行三点测交实验数据越多越精确, 实验室中果蝇数目有限这就使偶尔因素引起的误差的影响力加大，也是导致结果 与理论值有偏差的因素之一。加之三隐性个体的生存力很弱，在幼虫密度较高时 易在自然选择中被淘汰，在实验中此因素也有也许引起误差。并旦观测果蝇时， 有一些观测不到放走的,死掉的或者没有观测清楚的等等。但是虽然定量结果存 在一定偏差，但是此实验还是可以准确地反映三个基因的连锁位置关系。根据本 组实验数据计算出的并发率近似等于1,距此可判断此三个基因间不存在干扰。果蝇的生活周期长短与温度有密切关系。一般来说,3 0 °C以上温度能使果蝇不育或死亡，低温能使生活周期延长，生活力下降，饲养果蝇的最适温度为2 0八 25o生活周期长短与饲养温度的关系果蝇在25时,从卵到成蝇需1（）天左右，成虫可活2 63 3天。果蝇的生活1()1 5 2025 卵一幼虫 幼虫一成虫57天18天8天6天5天4天史如下：_为雌蝇一减数分鬻因二/受精雄蝇一减数分裂f精子第一批成虫 羽化（第八天）（可活f 6 33天）?（第四天）第二次蜕皮（第二天）产第一批卵第i批卵孵化（第零天）第一次蜕皮幼虫（第一天）果蝇的生活周期和各发育阶段的通过时间果蝇的性别及突变性状的鉴别：果蝇的每一体细胞有8个染色体（2n=8）,可配成4对，其中3对在雌雄果蝇 中是同样的，称常染色体。此外一对称性染色体，在雌果蝇中是XX,在雄蝇中 是X 丫。果蝇的雌雄在幼虫期较难区别，但到了成虫期区别相称容易。雄性个体一般 较雌性个体小，腹部环纹5条，腹尖色深，第一对脚的跑节前端表面有黑色鬃毛流 苏，称性梳(Sex combs)。雌性环纹7条，腹尖色浅，无性梳。实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定，例如红眼与白眼，正常翅 与残翅等。而另一些性状可在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。现列表如下：实验中使用的果蝇突变品系焦刚毛的基因座为s n 3,本文简写为sno影响部分突变名称基因符号染色体上座位翅残翅VgIIR 6 7. 0眼色白眼WX 1.5体色黑体bI IR 4 8.5刚毛焦刚毛snX 2 1.0翅形小翅mX 3 6.12 .野生型果蝇为红眼、灰身、长翅、直刚毛，与这些性状相应的突变性状 很多，其中灰身(+)与黑身(b)是一对相对性状,且灰身对黑身为完全显性，控 制这对相对性状的基因位于第二号染色体上。用品有这对相对性状的两纯合亲本 杂交，性状的遗传行为应符合分离定律。3 .黑体果蝇的体色为黑色(b),与之相相应的野生型果蝇的体色为灰色 (+),灰色对黑色为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上; 果蝇另一突变性状为焦刚毛(sn),与之相应的野生型性状为直刚毛(+)，控制这 对相对性状的基因位于第一号染色体上，直刚毛对焦刚毛为完全显性。用品有这 两对相对性状的纯合亲本杂交，其性状的遗传行为应符合自由组合定律。4 .生物某些性状的遗传常与性别联系在一起，这种现象称为伴性遗传(se x-li n ked inh e ritance)，这是由于支配某些性状的基因位于性染色体上。果蝇属 XY型生物，共有四对染色体，第一对为性染色体，其余三对为常染色体。雌果蝇 的性染色体构型为XX,、雄果蝇为XY。控制果蝇眼色的基因位于X染色体上， 在Y染色体则没有与之相应的等位基因。将红眼（十）果蝇和白眼（w）果蝇杂交， 其后代眼色的表现与性别有关。并且，正反交的结果不同。5 . 不完全连锁基因在形成配子时，随同源染色体非姊妹染色体单体之间 发生互换而互换，产生一定频度的重组型配子，在子代中表现一定比例的重组性 状，通过观测和记录测交子代各种表型的个体数，可估算出连锁基因间的互换率, 由此拟定基因在染色体上的相对位置，绘制出连锁遗传图。已知果蝇a m el a 77 0 gr）的红眼（+）对白眼（w）是显性，直刚毛（+）对焦刚毛（s n）是显性，长翅（十）对小型翅（m）是显性，控制这三对相对性状的基因都位于X染 色体上，若将白眼（W）、焦刚毛（SI1 ）、小型翅（m）三隐性突变体雌蝇（X'v 'nmxwsnm） 与红眼（ + ）、直刚毛（ + ）、长翅（+ ）野生型雄蝇（X+Y）杂交，则Fl可产生 三杂合体雌蝇（XW $nmx+）和三隐性雄蝇（Xw'nmY）。由于Y染色体上不携带 相应的等位基因，因而表现出X染色体上三个隐性基因所控制的性状，相称于一 个三隐性纯合体。用Fl代杂交（相称于测交）,F2代表现出的8种表型及数目与F 】雌蝇产生的8种配子及数目一致，通过观测和记录F2代（相称于测交子代）8 种表型的个体数，就可估算出这三对基因间的互换率,由此拟定这三对基因其在染 色体上的相对位置，绘制出连锁遗传图。【实验材料】不同品系的黑腹果蝇；黑身果蝇（b）:黑体、红眼、长翅、直刚毛（bb + +）品系； 三隐果蝇：灰体、白眼、小翅、焦刚毛（+ WW snsnmm）品系。 实验用品、药品：双筒解剖镜,银子，解剖针，毛笔，白瓷板，吸水纸，培养箱，饲养瓶（指管）， 麻醉瓶，棉花，乙醛，酒精，丙酸，培养基等。【实验操作】（一）果蝇实验技术1 .麻醉:对果蝇进行检查时,用乙醛麻醉，使果蝇处在昏迷状态。使用时将乙醒（23滴）滴到麻醉瓶的棉花球上（注意不要让乙醛流进瓶内），麻醉瓶要保 持干燥，否则会粘住果蝇翅膀，影响观测。麻醉果蝇时，先将长有果蝇的培养瓶 在海棉垫上敲，使果蝇所有震落在培养瓶底部，然后迅速打开培养瓶的棉塞，把 果蝇倒入去盖的麻醉瓶中，并立即盖好麻醉瓶，待果蝇所有昏迷后，倒在白瓷板 上进行观测。果蝇的麻醉限度看实验规定而定，对仍需培养的果蝇，以轻度麻醉为宜。但对 不再培养,单单进行性状观测的果蝇可以深度麻醉，甚至致死也无妨（果蝇翅膀 外展45。角,说明死亡）。检查完毕后，把不需要的果蝇倒入盛有煤油或酒精或水 的瓶中（死蝇盛留器）。2 .果蝇交配：将雌雄果蝇放在一起培养,雌蝇的生殖器中有贮精囊，可保存 交配所得的大量精子，雌蝇一次交配所得的精子,足够它多次排出的卵受精，因 此在做杂交实验时，雌蝇必须选用处女蝇（没有交配过的雌蝇）。雌蝇孵出后12 小时内不会交配，这个时间内把果蝇所有倒出，分出雌雄蝇，单独饲养，这时收 集的雌蝇是处女蝇。杂交时把所需品系的雄蝇直接放到处女蝇培养瓶中,贴好标 签,注明两亲本的基因型及交配日期，进行培养。78天后倒掉亲本（一定要倒 干净，以免亲代和子代混淆），待F1成蝇羽化后开始计算，观测性状。可靠的计数 及观测是培养开始的20天以内（再晚F2也也许有了）。若须继续实验，观测F2, 可在F1内挑出雌雄数对，此外培养,由于这次是用F1作亲本，进行个体间互交, 所以这时不是处女蝇也可以。但如要把F1雌蝇与另一品系雄蝇杂交时，还要严 格地选取处女蝇，方法同上。3 . 原种培养在作新的留种培养时，应事先检查一下果蝇有没有混杂，以防原种丢失。亲 木的数目一般每瓶510对，移入新瓶时，须将培养瓶横卧，然后用毛笔将麻醉的果 蝇从白瓷板上轻轻扫入,待果蝇醒过来后再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在饲料上。 原种每24周换一次培养基(依温度而定，1 01 5 C约4周换一次，202 5 C约 二周换一次)。每一原种培养至少保存两套，培养瓶的标签上要写明突变名称，培 养口期等。作原种培养温度可控制在1015,培养时避免日光直射。果蝇在适宜条件下会产子代，在肉眼能看到幼虫时就可把亲本倒掉,几天以 后，新的成蝇便产生。待成蝇有了足够保种的数量后,要调换培养瓶，作为下一代 的亲本，继续培养。原种果蝇培养碰到的麻烦是饲料发霉。发霉的因素很多，如用品没有灭菌， 空气污染，亲本不及时倒掉，都会引起饲料发霉。严重的霉菌污染会影响果蝇的 生长。饲料中加丙酸可以克制霉菌，但并不能完全制止。发现培养瓶中有少量霉 点时可用烧过的解剖针挑出。若大量霉菌污染，可把果蝇所有倒在一个消毒过的 空指管中，让它活动23小时,换一支指管，再活动12小时，而后倒入一支新 的培养瓶中继续培养，这样可以防止霉菌污染。原种保存碰到的另一个问题是混杂，几个不同品系的果蝇在一起培养，一定 要防止混杂。培养瓶的塞子要做得紧些，不使果蝇逃出。调换培养瓶时，要防止果 蝇飞散。外逃的果蝇要打死。发现了混杂的原种，要根据原种果蝇的所有特性， 挑出数对雌雄蝇饲养，进行筛选直到完全没有分离为止。这样做，费时费力，只是 在不得己时才采用。一般混杂时，只要方便，可以重新引种，将混杂种弃去。(二)果蝇杂交实验(1)果蝇的性状观测、性别鉴定及饲养。(2)选取杂交亲本中所用的母本必须是处女蝇。刚羽化的雌蝇在12h内一 般无交配能力。在杂交前放出亲本培养瓶中的所有成蝇，每隔1()1 2h收集一次 羽化的成蝇，并将雌雄蝇分开饲养。收集处女蝇数量的多少根据需要而定。(3 )麻醉接种 用黑身果蝇与三隐果蝇杂交，正反交同时进行。即三隐第X黑 身黑身早X三隐占。将所选处女蝇按品系分别麻醉，按不同杂交组合分别选取雌、雄蝇各61 0只 移入杂交瓶中，为了防止昏迷果蝇被培养基粘住，可将培养瓶放倒，将果蝇置于瓶壁，待其清醒后再将培养瓶直立，贴上标签:正交孕 BBx"nx*snxbbXiY&口期：反交q bb X，" X'l X BBX' ,rs"Y日期：将杂交瓶放在2 0 °C2 5 °C恒温箱内培养。(4)培养78d,倒掉杂交亲木(倒掉的果蝇最佳处死)。(5)再过45d,Fi代成蝇出现，观测Fi代性状是否和预期结果一致。(6)收集61 0对R代果蝇放入一新培养瓶，在20c25c恒温箱内继续培 养,以便观测F2代(正反交作相同解决)。(7)继续培养78d后，移去R代。(8 )再45d, F?代成蝇出现，开始观测并记录艮代的性状表现类型及数目。【结果记录分析】(一)数据记录正 交灰体黑体合计¥$早&红、长、直+1622124 756142 63 8 5 6白、小、焦1185115439736230 9 8白、长、直+3 0926 111377760红、小、焦+2642599996718红、长、焦+ +634922171 51白、小、直+8 19 726362 40红、小、直+3113 1 512712 8881白、长、焦+3412451 31757 92体色合计7 8 0 32 6 9 31 0 49 6性别合计4176362714761217性别合计565264844反交灰体黑体合计早8辛6红、长、直HF+35581 437115348 166 2 9白、小、焦1459 1 41223 131 49 4白、长、直一+4620527743 52红、小、焦+ -7319526623 56红、长、焦+ +41883141201白、小、直 F137312351 33红、小、直 HF1 573 189 61 25696白、长、焦一+61274267743 8体色合计7 5 9827 0 11 0299性别合计4094350 414931208性别合计宇5 58764712（二）记录分析1 .分离定律图谱分析BB华体）X bb （黑体）B b （灰体）P:F 1 :自交F2：BBBb理论灰体黑体实际正交数量：比值:反交数量：比值：780326 9 32. 9 0:175 9 827 0 12.81 ：1比值:X2检查正交基因体色基因(B/b)F2表型灰体黑体合计实得数o780 32 6 931 0 4 96预期数E78722 6 2410496x22.4 1 92P (n=l)0.100.50 (> 0 .05)(差异不显著)反交基因本色基因(A/a)表型灰体黑体合计实得数759827 0 110299预期数7724.2 52574.7510299X28.25 4 0P(n= 1 )<0.01(差异极显著)2 .自由组合定律图谱分析正交：P：灰体焦刚毛(B Bxsnx，ny 黑体直刚毛(b b X+ Y )Fl:BbX + Xsn x BbX$nY oF 2 : BBX+X'n BbX+Xsn BBXsnXsn BbXsnXsnbbX+XsnbbXsnXsnBbX+Y BBX+YBB XsnY B b XsnYb bX+Y