Western blot 实验介绍及流程.pptx

Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置目的与要求 掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤培训内容 熟悉western-blot 与SDS-PAGE的基本原理与实验流程考核题目第1页/共17页电泳槽玻璃板、梳子、加样校准架等电转移槽切胶板、黑白夹板、海绵垫等电泳仪Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置用途：用于生物学实验中对特定目的蛋白质的分离，定性及定量的检测分析，是Western-blot（蛋白免疫印迹）实验中非常重要的部分。第2页/共17页Western blot是利用已知的特异性抗体与抗原（即组织细胞中的目的蛋白）能特异性结合的原理，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂（如酶、金属离子、同位素）显示一定的颜色或发光来对组织细胞内目的蛋白定性及半定量的研究。Western blot 实验原理抗原一抗生物素标记的二抗ECL发光试剂第3页/共17页Western blot Western blot 检测蛋白表达实验流检测蛋白表达实验流程程提取总蛋白蛋白浓度测定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳ECL检测封闭二抗一抗洗涤洗涤扫描分析转膜第4页/共17页 SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-SDS-蛋白质复合蛋白质复合物物（电泳样品加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负蛋白质穿上带负电的电的“外衣外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量迁移率主要取决于其分子量的大小。的大小。SDS-PAGESDS-PAGE电泳的基本原理第5页/共17页1 A protein sample is subjected to electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel.Western blot 实验流程第6页/共17页SDS-PAGE电泳操作步骤（1）配制分离胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶（2）灌分离胶 灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液（3）配制浓缩胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶（4）灌浓缩胶 倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好,胶凝固好后有胶条的国产槽需要去掉胶条（浓缩胶与分离胶一般比例为1：3）（5）加Tris-甘氨酸电泳缓冲液 足量（6）上样 蛋白质含量要适量，上样总体积要适量（7）电泳 50V1h,100V2.5h，根据分子量的大小确定电压和时间，一般溴酚蓝离胶下cm停止电泳，上槽接负极，下槽接正极 第7页/共17页第8页/共17页2 Electroblotting transfers the separated proteins from the gel to the surface of a nitrocellulose membrane.Western blot 实验流程第9页/共17页（1）剥胶 用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶（2）准备滤纸和硝酸纤维素膜 切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致（3）浸泡滤纸、膜和海绵垫 用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风（4）制备“三明治”制备每一层时注意赶气泡（5）电转 75V，1.5h，在冰浴中进行，黑板对黑极（），白板对白极（）电转操作步骤第10页/共17页4 An antibody that is specific for the protein of interest(the primary antibody-Ab1)is added to the nitrocellulose sheet and reacts with the antigen.Only the band containing the protein of interest binds the antibody,forming a layer of antibody molecules Western blot 实验流程一抗孵育一抗孵育：必须选择可以抗抗原：必须选择可以抗抗原种属的一抗。如做大鼠目的蛋白种属的一抗。如做大鼠目的蛋白的检测，则我们选择的一抗可以的检测，则我们选择的一抗可以是来自兔、人、小鼠的是来自兔、人、小鼠的抗大鼠抗大鼠的的抗体。一抗浓度及孵育时间、温抗体。一抗浓度及孵育时间、温度很重要。度很重要。3 The blot is incubated with a generic protein(such as milk proteins or BSA)which binds to any remaining sticky places on the nitrocellulose.第11页/共17页5 Following several rinses for removal of non-specifically bound Ab1,the Ab1-antigen complex on the nitrocellulose sheet is incubated with a second antibody(Ab2),which specifically recognizes the Fc domain of the primary antibody and binds it.Ab2 is radioactively labeled,or is covalently linked to a reporter enzyme,which allows to visualize the protein-Ab1-Ab2 complex.Western blot 实验流程二抗孵育二抗孵育：二抗的选择根：二抗的选择根据一抗的种属来源，如：据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗体，则二抗应选择山的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体，羊或其他来源抗兔的抗体，而且二抗要标记有同位素而且二抗要标记有同位素或酶。或酶。第12页/共17页Western blot 实验流程6 ECL detection ECL Kit is based on the enzyme-linked immunodetection of antigen-specific antibody using anti-IgG secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase(HRP),which reacts with a chemiluminescent substrate in the presence of a chemical enhancer.ECLECL显色显色：ECLECL试试剂与过氧化物酶剂与过氧化物酶结合后发光后，结合后发光后，可用仪器自动检可用仪器自动检测或在暗室内用测或在暗室内用X-X-光片将其记录光片将其记录下来。下来。第13页/共17页Western blot 实验结果与分析 c-fosactin62kD42kD将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果第14页/共17页考核题目1.Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置的主要用途是什么？2.Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置主要由哪几部分构成？3.SDS-PAGE SDS-PAGE电泳中蛋白质迁移速率的快慢取决于什么？4.SDS-PAGE SDS-PAGE电泳的操作步骤是什么？注意事项有哪些？5.SDS-PAGE SDS-PAGE电转移的操作步骤是什么（详细列出“三明治”的先后顺序)？注意事项有哪些？6.Western-Blot Western-Blot的基本原理是什么？第15页/共17页第16页/共17页谢谢您的观看！第17页/共17页