细胞培养基本技术.pptx

1第四章第四章 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术4.1 4.1 基本操作技术和要求基本操作技术和要求 第1页/共57页2u培养前准备u制订试验计划和操作程序u准备各种器材物品u培养室和超净台的消毒u0.2%新洁尔灭托洗地面u紫外灯照射30-60分钟u以75%乙醇擦拭无菌操作台面培养室内的无菌操作培养室内的无菌操作第2页/共57页3u洗手和着装u彻底洗手u以75%乙醇消毒手和前臂u可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。u无菌培养操作u一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。u小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。培养室内的无菌操作培养室内的无菌操作第3页/共57页4第4页/共57页5第5页/共57页6第6页/共57页7第7页/共57页8第8页/共57页9无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误吸管、剪刀等碰到其他器皿第9页/共57页10无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误正确的拿管姿势错误的拿管姿势拿吸管时手碰到无菌区！拿吸管时手碰到无菌区！第10页/共57页11无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误无菌操作中常犯的错误培养基浸湿吸管底部的棉花第11页/共57页124.2 4.2 原代培养原代培养第12页/共57页13 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。细细 胞胞 和和 组组 织织 培培 养养 第13页/共57页14计 数 细 胞细胞数/ml=计数16格稀释倍数 104第14页/共57页15原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm20.1mm=1.0 x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dye exclusion（染料排除），利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。第15页/共57页16两两 个个 概概 念念 u原代培养u直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。u传代培养u细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。第16页/共57页17培养细胞的取材培养细胞的取材 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。第17页/共57页18组组 织织 块块 培培 养养 法法 新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。58第18页/共57页19第19页/共57页20第20页/共57页21第21页/共57页22第22页/共57页23第23页/共57页24第24页/共57页25培培 养养 要要 点点u材料新鲜u严格无菌操作u剔除脂肪等附着组织u组织块剪小（直径1mm1mm）u摆放开（间距5mm5mm）第25页/共57页26常常 犯犯 的的 错错 误误 u操作中不换器械u冲洗次数不够u组织碎片太大u组织块摆放太密u培养液加入太多第26页/共57页27消消 化化 培培 养养 法法u消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物 u消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞。59第27页/共57页2855切成1-2mm3小块20-60min第28页/共57页29第29页/共57页30第30页/共57页31第31页/共57页32第32页/共57页33第33页/共57页34第34页/共57页35培培培培 养养养养 要要要要 点点点点u35合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%）u合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37，20-40分钟）第35页/共57页36常 犯 的 错 误 水浴锅未预热组织块太大第36页/共57页37胰蛋白酶消化不足或过度吹打用力过重常 犯 的 错 误 第37页/共57页384.3 4.3 传代培养和细胞系的维持传代培养和细胞系的维持 第38页/共57页39传传 代代 细细 胞胞 培培 养养 细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。63第39页/共57页40首次传代注意事项u细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。u传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时处理。u首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。63第40页/共57页41细细细细 胞胞胞胞 传传传传 代代代代 方方方方 法法法法根据细胞生长的特点，传代方法有3 3种u悬浮生长细胞传代u离心法传代：离心（10001000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代u直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2l/22/32/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代u半悬浮生长细胞传代u此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代u贴壁生长细胞传代u采用酶消化法传代。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液64第41页/共57页42贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法u吸光培养瓶中的培养液uPBSPBS洗一次u加入1 12 ml 0.252 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）u静置2 210 min10 min（显微镜下动态监测）u吸去胰蛋白酶液，加入培养液u用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液u吸取1/101/101/401/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内u加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内u将后者放入培养箱中培养第42页/共57页43第43页/共57页44第44页/共57页45TrypsinTrypsin消化细胞消化细胞消化细胞消化细胞未消化细胞未消化细胞细胞消化过程细胞消化过程第45页/共57页46第46页/共57页47第47页/共57页48培培 养养 要要 点点u严格的无菌操作u适度消化第48页/共57页49细胞培养中需要注意的问题细胞培养中需要注意的问题u培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度uPHPH：初培养pHpH应为7.47.4，培养过程应不低于7.07.0u培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:101:10第49页/共57页50细胞培养中需要注意的问题细胞培养中需要注意的问题u容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.20.20.5ml/cm0.5ml/cm2 2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm2mm）中生长较好；需要低浓度氧的,在深的培养液（5mm5mm）中生长较好。u去除死细胞u温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.536.5，细胞生长缓慢；温度高于37.537.5，细胞存活力降低第50页/共57页51细胞系的维持u细胞系档案要记录好；u细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性，在维持传代时要注意保持其稳定的规律性；u多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间交叉污染；u每一种细胞系都应有充足的冻存储备。65第51页/共57页52培养细胞的纯化u自然纯化u人工纯化 酶消化法酶消化法机械刮除法机械刮除法反复贴壁法反复贴壁法克隆法克隆法培养基限定方法培养基限定方法流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法 65第52页/共57页534.4 4.4 培养细胞生长状况的观察培养细胞生长状况的观察 第53页/共57页54培养细胞的常规观察培养液细胞生长概况细胞形态变化微生物污染68第54页/共57页55活细胞的观察培养细胞相差显微镜观察培养细胞的动态观察69第55页/共57页56细胞生长状况的观察l细胞计数l细胞生长曲线l细胞分裂指数l细胞贴壁率l细胞周期71第56页/共57页57感谢您的观看！第57页/共57页