siRNA与癌症治疗的探究.pptx
siRNA的简介 小干扰小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为有时称为短干扰短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默）或沉默RNA（silencing RNA），是长度），是长度20到到25个核苷酸的个核苷酸的双股双股RNA，在生物学上有许多，在生物学上有许多不同的用途。目前已知不同的用途。目前已知siRNA主要参与主要参与RNA干扰（干扰（RNAi）现象，）现象，以带有以带有专一性专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi（RNA interference 核糖核酸干扰）相关的反应途径，例如核糖核酸干扰）相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变、阻断细胞内可能发生的有害活抗病毒机制或是染色质结构的改变、阻断细胞内可能发生的有害活动，如肿瘤细胞的生长，但是要成功地将动，如肿瘤细胞的生长，但是要成功地将siRNA传送到特异性的细传送到特异性的细胞中而不对其它细胞产生不利影响还一直是个难题。胞中而不对其它细胞产生不利影响还一直是个难题。本次本次第1页/共19页siRNA的结构siRNA通常是一段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，图示如下：每一股各有一个5磷酸基末端与一个3羟基末端。此结构经dicer作用而得，dicer是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)。此外，siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果。本质上，任何已知序列的基因都可以、也因此是经过适当剪裁而具有序列互补性的siRNA的作用对象。这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。第2页/共19页RNAi RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象,是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制,同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用，因此在治疗癌症肿瘤中有很大的应用前景，因此在治疗癌症肿瘤中有很大的应用前景。第3页/共19页siRNA发挥RNAi作用的过程 siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA激活的RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默。第4页/共19页归纳siRNA的特点 依赖依赖Dicer酶的加工，是酶的加工，是Dicer的产物，所以具有的产物，所以具有Dicer产物的特点。产物的特点。2长度约在长度约在22nt左右。左右。1是是RISC组分。组分。4 生成需要生成需要Argonaute家族蛋白存在家族蛋白存在3 植物体内也存在内源的植物体内也存在内源的siRNA。5第5页/共19页siRNA在RNAi应用中的缺陷 在在RNAi实验中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到实验中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容进入细胞后容易被降解；进入细胞易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的在细胞内的RNAi效应持续时间短。效应持续时间短。针对这种情况，针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。体内表达。该方法的基本思路是：该方法的基本思路是：将将siRNA对应的对应的DNA双链模板序列克隆入载体的双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶聚合酶III的启动子后，的启动子后，这样就能在体内表达所需的这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。，能达到较长时间的基因沉默效果。第6页/共19页质粒表达siRNA的优点 通过质粒表达通过质粒表达siRNAs大都是用大都是用Pol III启动子启动编码启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用的序列。选用Pol III启动子的原因在于启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到遇到45个连续的个连续的U即终止，非常精确。当这种带有即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子启动子和和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，表达质粒的选择标记，siRNA载载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。的成本。第7页/共19页 此外，带有抗生素标记的此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久（比如达数星期甚至更久（比如Clontech（现属于（现属于Takara）的）的RNAi-Ready表达载体）。另外带有荧光标记的表达载体）。另外带有荧光标记的siRNA表达载体也表达载体也受到研究者的重视与欢迎，因为带荧光标记的表达载体，可以受到研究者的重视与欢迎，因为带荧光标记的表达载体，可以让研究人员通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的让研究人员通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有基因的沉默效率。可通过荧光显微镜观察含有shRNA的细胞的细胞或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与或通过流式细胞仪富集被转染的细胞。同时荧光蛋白的表达与shRNA的表达是独立的，因此不影响的表达是独立的，因此不影响shRNA基因沉默的效果。基因沉默的效果。带有标记的siRNA表达载体第8页/共19页研究人员将编码人类端粒酶研究人员将编码人类端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR），），长长67bp的寡核苷酸引入的寡核苷酸引入pSIREN一种重组腺病毒构建中的穿梭载体。一种重组腺病毒构建中的穿梭载体。然后将然后将U6-RNA启动子和启动子和siRNA编码编码insert从从pSIREN上剪切下来，亚克隆进上剪切下来，亚克隆进pAdeno-X，构建出了质粒，构建出了质粒pAd-hTR。接着研究人员将接着研究人员将pAd-hTR转染进哺乳动物细胞系转染进哺乳动物细胞系HEK-293，获得了携带，获得了携带有有hTR靶向的靶向的siRNA（Ad-hTR-siRNA）的腺病毒。通过一系列的实验，研）的腺病毒。通过一系列的实验，研究人员证明了究人员证明了Ad-hTR-siRNA介导的端粒酶沉默在介导的端粒酶沉默在HeLa细胞中的作用。同时细胞中的作用。同时将将Ad-hTR-siRNA与与Ad-NT-siRNA进行比对，发现前者能极大的降低进行比对，发现前者能极大的降低HeLa细细胞中胞中hTRmRNA水平（水平（by 70.21%），和端粒酶活性（），和端粒酶活性（by 58.87%）。而且）。而且会引起会引起HeLa细胞凋亡。细胞凋亡。利用利用Ad-hTR-siRNA进行皮下肿瘤异种移植治疗可以减缓肿瘤的生长，其进行皮下肿瘤异种移植治疗可以减缓肿瘤的生长，其中至少部分是由于体内细胞凋亡（中至少部分是由于体内细胞凋亡（P0.05）。总而言之，这些研究结果证明）。总而言之，这些研究结果证明了了hTR siRNA在在HeLa细胞系中有效和特异的端粒酶的敲除，从而指出了这种细胞系中有效和特异的端粒酶的敲除，从而指出了这种siRNA表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。表达重组腺病毒系统在癌症基因治疗方面的前景。siRNA病毒载体减缓肿瘤生长第9页/共19页siRNA在卵巢癌治疗中的实验探究在卵巢癌治疗中的实验探究siRNA在胃癌治疗中的实验探究在胃癌治疗中的实验探究siRNA与癌症的实验与癌症的实验siRNA在其他癌症治疗中的应用在其他癌症治疗中的应用第10页/共19页 德克萨斯州学德克萨斯州学M.D.AndersonM.D.Anderson癌症中心的项新研究显癌症中心的项新研究显示，装载在一微小的脂肪球中的一种分子开关示，装载在一微小的脂肪球中的一种分子开关（siRNAsiRNA）能够渗入卵巢癌肿瘤细胞中）能够渗入卵巢癌肿瘤细胞中“掐死掐死”一种讨一种讨厌的蛋白并明显缩小肿瘤的尺寸厌的蛋白并明显缩小肿瘤的尺寸。该。该项研究的结果刊登项研究的结果刊登在在8 8月月1515日的日的Clinical Cancer ResearchClinical Cancer Research杂杂志志上上，这项研究这项研究还成还成为为该期杂志的封面故事。该期杂志的封面故事。小鼠模型实验证实一种强有力的短干扰小鼠模型实验证实一种强有力的短干扰RNARNA（siRNAsiRNA）传递系统能够攻击癌症。）传递系统能够攻击癌症。SiRNASiRNA是一种是一种能用于沉默基因关闭有害蛋白制造的伟大技术。在离体能用于沉默基因关闭有害蛋白制造的伟大技术。在离体实验中，这种技术的效果很好，但是难点是如何能够让实验中，这种技术的效果很好，但是难点是如何能够让它进入到肿瘤中。因为短的它进入到肿瘤中。因为短的RNARNA片段在没有被直接注射片段在没有被直接注射的情况下无法进入到肿瘤中，并且实验室用的注射方法的情况下无法进入到肿瘤中，并且实验室用的注射方法在临床中是不能适用的。在临床中是不能适用的。2/14/2023siRNA在卵巢癌症治疗的发现第11页/共19页这研究组将能靶向一种促进卵巢癌细胞存活和扩散的蛋这研究组将能靶向一种促进卵巢癌细胞存活和扩散的蛋白质的白质的siRNAsiRNA转载进一种脂质体（一种脂肪球，体积非转载进一种脂质体（一种脂肪球，体积非常小）中。研究人员对感染了三种人类卵巢癌细胞系的常小）中。研究人员对感染了三种人类卵巢癌细胞系的小鼠进行了小鼠进行了3 3到到5 5周的处理。这些小鼠接受了含有周的处理。这些小鼠接受了含有FAK FAK siRNAsiRNA、对照、对照siRNAsiRNA或空处理。一些小鼠接受了或空处理。一些小鼠接受了siRNAsiRNA脂质体和化疗药物脂质体和化疗药物docetaxeldocetaxel。实验结果显示，接受了实验结果显示，接受了FAKFAK沉默脂质体的小鼠的肿瘤重沉默脂质体的小鼠的肿瘤重量与对照组相比，减少了量与对照组相比，减少了44447272；联合使用了；联合使用了FAKFAK沉默脂质体和药物沉默脂质体和药物docetaxeldocetaxel的小鼠，其肿瘤肿瘤减少了的小鼠，其肿瘤肿瘤减少了94949898。而且这种联合方法对。而且这种联合方法对docetaxeldocetaxel抗性卵巢癌抗性卵巢癌细胞系同样有用。细胞系同样有用。2/14/2023第12页/共19页2/14/2023武汉大学中南医院胃肠科教授邓长生在International Immunopharmacology上发表RNAi文章，解析以siRNA治疗胃癌的新成果。胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在癌症致死原因中列第二。武大中南医院邓长生教授、夏冰教授等在先前的研究中发现了多个易感基因，与湖北汉族人胃癌显著相关，尤其是在湖北汉族人群肿瘤坏死因子基因位点上，检测出一新的等位基因，为胃癌的早期诊断和治疗提供了一项新方法。找到靶位基因后，邓长生教授等尝试用最新的RNAi技术治疗胃癌。邓教授研究小组以survivin为靶位设计siRNA，构建了一个Psilencer 2.1-surivin siRNA质粒，并将该质粒导入胃癌MGC-803细胞系中，同时还将该细胞系注入裸鼠体内，观察该siRNA的效果。结果发现，小鼠细胞内的surivin基因转录的mRNA量显著下降，并且surivin蛋白表达量也下降，癌细胞凋亡率升高。总的来说，该siRNA靶位可有效的抑制胃癌细胞增殖，可能成为胃癌的潜在治疗靶位。siRNA在胃癌症治疗的发现第13页/共19页2/14/2023Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关。Survivin是目前发现最强的凋亡抑制因子，Survivin功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化并且参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用。目前，Survivin已成为研究的热点。Survivin在人类各种肿瘤组织癌细胞中含量很丰富，但在正常细胞中却几乎不存在。体内外研究表明，Survivin可在多 种转化细胞系中表达，并见于所有人类最常见的肿瘤组织，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。Survivin蛋白质结构第14页/共19页 靶向靶向surviv insurviv in的的siRNAsiRNA对胃癌对胃癌BGC-823BGC-823细胞增殖细胞增殖的影响的影响设计并合成设计并合成3 3条靶向条靶向surviv insurviv in的小分子干扰的小分子干扰RNA(siRNA),RNA(siRNA),构建表构建表达性干扰达性干扰RNARNA质粒质粒(shRNA)shRNAsurvivin-1(shRNA)shRNAsurvivin-1、shRNA-surv iv shRNA-surv iv in-2in-2和和shRNA-surv iv in-3,shRNA-surv iv in-3,分别转染胃癌分别转染胃癌BGC-823 BGC-823 细胞细胞,实时定实时定量量PCRPCR检测干扰检测干扰RNA RNA 沉默沉默surv ivin mRNA surv ivin mRNA 表达效果表达效果,W estern b,W estern b lo tlo t观察对胃癌观察对胃癌BGC-823 BGC-823 细胞细胞surv iv insurv iv in蛋白质表达的抑制蛋白质表达的抑制,MTT(,MTT(四甲基偶氮唑盐四甲基偶氮唑盐)比色法分析检测细胞生长抑制率比色法分析检测细胞生长抑制率,流式细胞计数流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡率检测各组细胞周期和凋亡率,探讨干扰探讨干扰RNA RNA 对胃癌对胃癌BGC-823BGC-823细胞细胞生长的影响。生长的影响。2/14/2023第15页/共19页结果结果 在体外在体外,shRNA-surv iv in-1,shRNA-surv iv in-1有效沉默人胃癌有效沉默人胃癌BGC-823BGC-823细胞细胞surv iv in mRNA surv iv in mRNA 的表达的表达,使使surviv in mRNA surviv in mRNA 相对水平明显降低相对水平明显降低(P 0.05),su rv iv inP 0.05),su rv iv in蛋白质表达抑制蛋白质表达抑制,72 h,72 h细胞生长抑制率达细胞生长抑制率达74.74.92%(P 0.05),shRNA-surv iv in-192%(P 0.05),shRNA-surv iv in-1使使G2/M G2/M 期细胞百分比明显期细胞百分比明显增加增加,凋亡率显著增加凋亡率显著增加(P 0.05)(P 0.05)。结论结论 shRNA-surv iv in-1 shRNA-surv iv in-1可以沉默可以沉默surv ivinsurv ivin基因的表达基因的表达,可以显著可以显著抑制胃癌抑制胃癌BGC-823BGC-823细胞的增殖细胞的增殖,在一定程度上诱导其自发凋亡。在一定程度上诱导其自发凋亡。2/14/2023第16页/共19页siRNA-survivinsiRNA-survivin与与GRIM-19GRIM-19共表达质粒对前列腺共表达质粒对前列腺癌癌DU145DU145细胞生长具有抑制作用细胞生长具有抑制作用siRNAsiRNA阻抑阻抑survivinsurvivin基因表达可诱导乳腺癌细胞基因表达可诱导乳腺癌细胞的细胞凋亡的细胞凋亡Survivin-specific small interfering RNAs enhance Survivin-specific small interfering RNAs enhance sensitivity of glioma U-87MG cells to paclitaxel sensitivity of glioma U-87MG cells to paclitaxel by promoting apoptosisby promoting apoptosis2/14/2023第17页/共19页第18页/共19页感谢您的观看！第19页/共19页
