T_SHRH 007-2018 化妆品-体外皮肤刺激性测试方法（ET-50）.docx

目次前言21.范围32.参考资料33. 术语、定义和缩略语34.试验方法45 试验结果71化妆品-体外皮肤刺激性测试方法（ET-50）1范围本标准规定了皮肤模型对体外皮肤刺激性试验的术语和定义、试验方法和试验结果。本标准适用于对化妆品、化学品进行皮肤刺激性的测定。2参考资料本方法参考In Vitro safety testing for skin irritation using the 3D reconstructed human epidemis制定。3术语、定义和缩略语3.1术语、定义3.1.1皮肤刺激性skin irritation皮肤涂覆受试样品后局部产生的可逆性炎性变化。3.1.2细胞活力cell viability测量细胞群总活性的参数，例如细胞线粒体脱氢酶对活性染料MTT的还原能力，这主要与活细胞的总数和/或活力相关。3.1.3半数有效时间median effective time固定浓度下施用受试样品后将细胞存活率降低50所需的暴露时间。3.2 缩略语3.2.1ET50 median effective time（半数有效时间）3.2.2MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide 3-（4,5 -二甲基- 2 -噻唑）-2,5 二苯基-2 氢-四氮唑溴盐3.2.3OD - Optical Density (吸光度)3.2.4PBS  phosphate buffered saline （磷酸盐缓冲液）3耗材或仪器名称用途说明无菌 24 孔板用于 MTT 孵育和浸提无菌 6 孔板用于培养 3D 表皮模型无菌 96 孔板用于读取浸提液体吸光度超净工作台提供百级洁净工作环境CO2 培养箱用于培养 3D 表皮模型孔板振摇器辅助溶解甲瓒结晶计时器控制试验中的操作时间无菌镊子夹取 3D 表皮模型试剂名称生厂商/货号保存条件/时间PBS博士德/PYG141904, 6 个月Triton X-100SIGMA/ T8787室温, 2 年MTTSIGMA/V900888-20, 1 个月异丙醇国药集团化学试剂有限公司/90109218室温, 2 年内容物规格保存条件/时间®体外重组 3D 表皮模型:EpiKutis24 个模型/孔板4, 3dEpiRecovery 培养液按每个模型使用 5mL 计算4, 14d4试验方法4.1 试验材料4.1.1 体外重组 3D 表皮模型检测试剂盒：表1体外重组3D表皮模型检测试剂盒内容物4.1.2 试验材料表2试验试剂详细信息4.1.3 试验耗材与设备表3试验耗材和设备及用途说明4无菌止血钳在清洗过程中，夹取 3D 表皮模型无菌尼龙膜辅助液体受试物在模型表面的铺展500 mL 塑料清洗瓶用于盛装 PBS，清洗 3D 表皮模型2000 mL 烧杯用于 PBS 溶液配制研钵用于研碎固体样品正向加液器吸取凝胶、乳膏、半固体测试物或悬液等酶标仪用于读取浸提液体吸光度封口膜防止异丙醇挥发无菌棉签用于擦拭模型表面液体残留物吸水纸用于吸干 3D 表皮模型外部的残余液体表 3（续）试验耗材和设备及用途说明4.2试验步骤4.2.1试剂盒接收与检定收到试剂盒后，打开外包装。肉眼观察模型与固体培养基接触界面是否有气泡。如发现模型接触界面有明显气泡，应作丢弃处理。4.2.2模型复苏a)准备充足的无菌6孔板（按每3个模型准备一个6孔板），去除6孔板外包装后，放入超净工作台内。在6孔板每孔中添加0.9mL EpiRecovery培养液，将剩余EpiRecovery培养液放入4冰箱保存备用。b)打开模型内包装袋，观察表面及四周是否有液体渗出或收缩现象，如表面存有大量水分，应作丢弃处理。c)用无菌镊子沿塑料壁上缘夹出模型，并在模型包装孔板中自带的无纺布上轻轻拭去模型底部的琼脂或其他液体。d)在加有EpiRecovery培养液的6孔板的第一排依次放入3个模型。放入模型时，应适当倾斜模型底面，使模型与EpiRecovery培养液充分接触，防止产生气泡。e)将放有模型的6孔板全部转移至CO2培养箱（37±1、5±1%CO2、95%相对湿度）中，孵育60±5min。f)培养结束后，用无菌镊子将模型从6孔板的第一排转移到第二排孔中，再将6孔板放回到CO2培养箱（37±1、5±1% CO2、95%相对湿度）中孵育过夜（18±3h）。4.2.3测试准备5a)配置1%（V/V）TritonX-100溶液。使用正压移液器吸取100L TritonX-100，加入到10mL无菌离心管中，再向离心管中补加9900L PBS溶液，吹打溶解后，用0.22m 滤器过滤，盛装于10mL无菌离心管中，4冰箱保存备用。b)实验分组包含对照组（1%（V/V）TritonX-100）和样品组。对照组给药时间设定为：0h（不给药），2h，4h；驻留型样品给药时间一般设定为：0h（不给药），6h，16h，24h；洗去型样品给药浓度一般设定为：2%，给药时间一般设定为：0h（不给药），6h，16h，24h。c)样品组给药时间可参考样品的其他信息进行微调。d)受试物预处理：在37或低温条件下能够用移液器吸取的受试物以液体受试物对待。粘稠、蜡状、树脂状、凝胶状等受试物在37±1条件下孵育15±1min，若处理后能够用移液器吸取则以液体受试物对待，若不能则以固体受试物对待。粉末状、颗粒状等受试物以固体受试物对待。e)给对照组各时间点准备一个新的6孔板，标记与对照组各时间点对应，并在6孔板第一排孔中添加0.9 mL的EpiRecovery培养液。为样品组各时间点准备新的6孔板，同一检测时间点的两种不同受试样品可合用一个6孔板，标记与实验分组&时间点对应，并在6孔板各孔中添加0.9mL的EpiRecovery培养液。其中，各样品组0h时间点可采用对照组0h时间点数据，不予重复准备模型。f)将复苏结束后的模型转移至标记后的6孔板中，每种受试物&时间点对应3个模型重复。4.2.4 受试物给药（在超净工作台中进行以下操作）a)对模型进行受试物给药操作。每个模型给药操作时间控制在1 min2min。b)受试物根据其物理性质分为两种给药方式：1） 液体受试物：对照组（1% (V/V)Triton X-100）和样品组的模型表面给药量为80L，采用正压移液器缓慢滴加于模型表面。给药后，用无菌镊子轻轻晃动模型，使受试物在模型表面均匀铺展。2） 固体受试物：先在模型内表面加入80µL PBS润湿表面，再称取80mg固体粉末均匀铺展于模型表面。对照组（1% (V/V)Triton X-100）给药量为80L。给药后，用镊子轻轻晃动模型，促进固体受试物在模型表面的均匀铺展，必要时采用移液器枪头辅助固体受试物铺展。注意：驻留型样品按照原液给药，洗去型样品按照2%的稀释浓度给药。c)最后一个模型给药结束后，将所有含有模型的6孔板转移到CO2培养箱中孵育培养（37±1、5±1% CO2、95%相对湿度），培养时间与各组设定好的时间一致。4.2.5 清洗及后孵育（在超净工作台中进行以下操作）a)受试物给药结束后，开始清洗程序。用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，保持PBS匀速、不间断地流出。重复清洗15次后，在装有无菌PBS溶液的烧杯中浸洗模型内、外表面，后用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。每个模型的清洗总时间控制在1min2min，保证该模型及试验中后续模型的给药时间一致。64.2.6 MTT 检测（超净工作台中进行以下操作）a)MTT工作液配制：用无菌PBS配制5mg/mL MTT贮存液，避光贮存于-20，保存时间不超过一个月。MTT检测前，用无菌PBS溶液稀释MTT贮存液至1mg/mL，现用现配。b)根据模型总数量准备24孔板，并做相应标记。每孔加入0.3mL 的 MTT工作液。注意：避光操作。c)将后孵育结束的模型从CO2培养箱中取出，用无菌镊子夹取模型，并在无菌吸水纸上拭去模型底面的残留液体；将模型转移至相应标记的24孔板中，使其与MTT溶液充分接触。将装有模型的24孔板放置于CO2培养箱中（37±1、5±1% CO2、95%相对湿度），孵育3h±5min。d)MTT孵育结束后，用移液器从24孔板中吸弃MTT溶液，后在每孔中加入200L PBS溶液，清洗模型外表面，重复此清洗过程3次。e)清洗结束后，将模型外表面用无菌棉签擦干，转移到新的24孔板中，并做好标记。在模型内表面加入2mL异丙醇，确保加入的异丙醇能够浸没整个模型内腔。f)用封口膜密封24孔板，避免异丙醇挥发，于4静置过夜或在孔板振摇器上震荡2h。g)用200L移液器枪头刺穿模型，使异丙醇浸提液从模型内流出到24孔板中。丢弃被刺穿的模型，每孔内的异丙醇浸提液至少吹打3次，使其充分混匀。h)混匀后，从每孔中吸取2份200L异丙醇浸提液，各自加入96孔板的对应孔中，做好标记。采用异丙醇作为吸光度检测时的对照。i)于酶标仪570nm波长读取吸光度（OD）值。j)按以下公式计算相对组织活力。相对组织活力=样品组OD值/阴性对照OD值*100% 。5试验结果基于各实验组&时间点模型的相对组织活力，绘制组织活力随暴露时间变化曲线，计算ET50值。ET50值为相对活力下降至50%的暴露时间。7参 考文献1Costin GE, Raabe H, Curren R. In Vitro safety testing for skin irritation using the 3D reconstructedhuman epidemisJ. Romanian Journal of Biochemistry,2009,46(2): 165-186._8