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基于i PSCs的疾病建模和临床研究,生物工程论文摘 要： 自2006年Takahashi和Yamanaka报道生成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)以来，多能干细胞领域进入了史无前例的发展状态，在疾病建模、药物发现以及细胞疗法等各方面都发挥重要作用，促进了细胞生物学和再生医学等学科的发展。当前，iPSCs技术已成为研究病理机制的重要工具，利用iPSCs技术挑选的新药物正在研发中，使用iPSCs衍生细胞的临床试验数量也在逐步增长。iPSCs与基因编辑技术以及3D类器官相结合的最新研究进展促进了iPSCs在疾病研究中的进一步应用。本文介绍了近年来重编程方式方法的革新，分析了整合病毒载体系统、整合非病毒载体系统、非整合病毒载体系统以及非整合非病毒载体系统四种重编程方式方法的利弊；同时综述了iPSCs在疾病建模以及临床治疗等方面的最新研究进展，为促进iPSCs各领域的深切进入研究提供参考。 本文关键词语： iPSCs; 重编程; 疾病建模; 细胞疗法; Abstract： Since Takahashi and Yamanaka reported the generation of induced pluripotent stem cells(iPSCs) in 2006, the field of pluripotent stem cells has entered an unprecedented state of development. It plays an important role in disease modeling, drug discovery and cell therapy, and promotes the development of cell biology and regenerative medicine. At present, iPSC technology has become an important tool for studying of pathological mechanisms. New drugs screened by iPSC technology are being developed, and the number of clinical trials using i PSC-derived cells is gradually increasing. The latest research progress of iPSCs, combined with gene editing technology and 3D organoid methodology, promotes the further applications of iPSCs in disease research. In this review, we introduce the innovation of reprogramming methods in recent years, analyze the advantages and disadvantages of four reprogramming methods: integrated virus vector system,integrated non-viral vector system, non-integrated virus vector system and non-integrated non virus vector system. At the same time, we summarize the latest research progress on iPSCs in disease modeling and clinical treatment strategies, so as to provide a reference for further in-depth research in various fields of iPSCs. Keyword： iPSCs; reprogramming; disease modeling; cell therapy; 最初人们以为，动物的成熟体细胞的基因组被永久锁定在体细胞状态，无法恢复到具有完全的多能性状态1。然而，1958年Gurdon等2将非洲爪蟾(Xenopus laevis)蝌蚪的体细胞核注射到同一物种的去核卵母细胞中，由此产生了一只功能完善的蝌蚪。39年后，Wilmut等3利用核移植技术培育了第一个哺乳动物克隆羊 多莉 。这些克隆研究表示清楚，分化细胞仍然保存着对机体发育至关重要的 遗传 记忆。1981年，Evans等4发现胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)能够从小鼠囊胚的内细胞团中获得，其后Thomson等5从人囊胚内细胞团成功获得了人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)。ESCs是多能的，它们具有无限制的自我更新能力，同时拥有向所有细胞类型分化的潜能。1987年，Weintraub等6发现单个基因Myo D的表示出能够将小鼠成纤维细胞转化为骨骼肌细胞。这一发现证明每种细胞都有本身的主调节基因，这些主调节基因起到维持细胞特性的作用。2006年，Takahashi和Yamanaka7从24个不同的基因入手，通过逆转录病毒载体向体细胞引入转录因子，结果发现引入4种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)能够将小鼠成纤维细胞转化为多能状态，进而建立了诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)技术。 2007年，日本京都大学Takahashi研究小组和美国威斯康星大学Yu研究小组分别报道了从人成纤维细胞中产生人类诱导多能干细胞(hi PSCs)的案例8,9。自此，迅速发展起来的hi PSCs技术为疾病建模、药物发现和再生医学领域开启了一个令人兴奋的现代。鉴于hi PSCs在疾病建模方面相对于传统细胞挑选的优势，将hi PSCs模型用于药效和潜在毒性的药物挑选变得越来越流行。hi PSCs的优点包括它们起源于人类、易获得、可扩展和能够产生几乎所有所需的细胞类型，避免与h ESCs相关的伦理问题，以及具有能够利用患者特定的i PSCs开发个性化药物，进行个性化治疗的潜力。随着3D培养技术以及基因编辑技术，十分是CRISPR/Cas9技术的发展，hi PSCs在人类疾病建模和基于干细胞的临床治疗方面展示出宏大的前景。本文主要介绍了重编程方式方法的革新以及i PSCs在人类遗传疾病建模和细胞治疗方面的最新发展，总结了当前i PSCs技术面临的挑战并讨论了解决这些问题的方式方法。 1、 重编程方式方法 1.1 、OSKM转录因子的作用 Oct4是一种与多能干细胞(PSCs)的多能性维持有关的同源域转录因子。Sox2在控制Oct4的表示出中起着至关重要的作用10，与Nanog和Oct4一起构成了多能性的关键转录网络。c-Myc是一种与多种癌症病因相关的原癌基因，负责招募染色质修饰蛋白，诱发广泛的转录激活。由于c-Myc有一定的致瘤性，后续有研究用无转化活性的L-Myc替代以解决此问题11。Klf4作为肿瘤蛋白或肿瘤抑制因子，是白血病抑制因子的下游靶点，能激活Sox2的表示出12。重组转录因子与体细胞多能性相关序列结合的能力主要受DNA甲基化、组蛋白修饰和ATP依靠性染色质重塑产生的染色质构造变化的调节13。据Stadtfeld和Hochedlinger14的报道，细胞的多能性被诱导时会激发两个转录波。在第一个转录波中，c-Myc通过甲基化的H3K4me2和H3K4me3与体细胞基因组相结合，标志着染色质的重塑。随后是体细胞相关基因表示出的沉默，包括Thy1、Snai1、Snai2、Zeb1和Zeb2等间充质基因13,15。第二个转录波更局限于染色质重塑的细胞。OSKM到达早期多能相关基因(pluripotency-associated genes,PAG)的加强子和启动子，并触发其转录和表示出。在这里转录波中，体细胞被迫改变其形态，加强增殖，并经历间充质样向上皮样的转化(mesenchymal-to-epithelial transition,MET)。这导致了Cdh1、Epcam和Ocln等上皮基因的上调和上皮特征基本状态的建立16，构成了更大的ES样细胞团。但MET是一个随机和低效的经过，由于多能诱导基因上存在甲基化组蛋白，而甲基化组蛋白负责封闭染色质构象13。 Klf4在这两个阶段都扮演着重要的角色。首先，在第一阶段Klf4结合并激活包括E-cadherin在内的上皮基因，抑制分化基因17。其次，在第二阶段加速内源性Oct4和Sox2的表示出，进而建立维持多能状态的自我调节环。Klf4通过控制细胞的发育、增殖、分化和凋亡等经过，在多能干细胞中发挥重要的作用。Klf4与Oct4和Sox2之间超强的互相作用激活一组如Nanog、Esrrb、Klf2、Sall4和ZFP42等转录因子，以及如Smad1和Stat3等信号通路调节因子18。 1.2、 重编程载体 在Yamanaka的创始性研究之后，陆续有几个研究室使用不同的方式方法来生成i PSCs，以知足有效治疗应用的安全性和质量标准。这些重编程策略大致分为两组：(1)通过基因整合或非整合转移系统；(2)利用病毒或非病毒方式方法。两组重编程策略将现有的重编程方式方法主要分为四种：整合病毒载体转移系统、整合非病毒载体转移系统、非整合病毒载体转移系统以及非整合非病毒载体转移系统，通过4种重编程方式方法将各类细胞重编程成i PSCs的经过如此图1所示。每种方式方法都有其优缺点，当前并未找到一个无限制或无潜在不良后果的单一的重编程转移系统。 1.2.1、 整合病毒载体转移系统的重编程 i PSCs最初是通过逆转录病毒载体引入重编程因子产生的，逆转录病毒载体已被广泛用作体外和体内研究的基因转移载体19。在重编程经过的后期，由于表观遗传修饰20，转入基因的表示出被沉默21，逆转录病毒载体只提供外源DNA序列的瞬时表示出。若没有能完全激活与多能性相关的内源基因的表示出，通过逆转录病毒载体生成的i PSCs的质量将遭到部分损害22。除此之外，一些报道指出，病毒转基因的重新激活及其在产生i PSCs中的残留活性会改变细胞的发育经过，并可能导致嵌合动物肿瘤的构成23,24。 慢病毒载体(lentivirus,LV)因其广泛的亲和性而被以为比逆转录病毒载体愈加有效24，因而LV被用来重编程很多体细胞类型。LV基因传递方式方法如今还是最有效的重编程策略之一，重编程效率为0.1%1%14,25，但科学家们仍在努力改善这一途径的安全性26。在设计有效的重编程LV方面获得的进展之一是研制了一种多顺反子LV，它在一个表示出系统中携带了由源自口蹄疫病毒的2A 自裂 肽序列连接的一个启动子驱动的四个重编程因子23,27。该系统减少了病毒在转基因细胞中整合的拷贝数，降低了转基因沉默的风险，简化了转化经过，并建立了一致的重编程因子的化学计量法28。除此之外，为了消除低效率沉默和转基因再激活的影响，通过引入可切除载体(Cre/lox P系统)29和可诱导系统(四环素/强力霉素诱导系统)26,30重组多顺反子病毒载体，整合后的转基因能够通过瞬时表示出Cre从宿主细胞基因组中移除。但这种策略的转移效率很低31，并且可能导致i PSCs突变，由于Cre/lox P系统在重新编程后可能会留下lox P的痕迹32。 图1 产生i PSCs的各种细胞来源和重编程方式方法 Fig.1 Various cell sources and reprogramming methods for the generation of i PSCs 1.2.2 、整合非病毒载体转移系统的重编程 由于当前整合病毒转移系统的局限性，科学家们一直在积极研究其他重编程方式方法，如非病毒转移系统，这些方式方法对于治疗应用更安全。第一个成功的非病毒性i PSCs是由成熟的胚胎成纤维细胞经两个质粒载体转染产生的：第一个质粒编码c-Myc，而第二个质粒多顺反子载体编码OSKM重编程因子23。这些发现表示清楚OSKM的瞬时过表示出足以诱导体细胞的多能性，但是整合的风险和重编程的效率低下又成了主要问题33。科学家们又设计了一个整合的依靠性基因转移载体，将转录因子整合到重组构造的lox P位点中以解决整合风险的问题28,29。然而，短的载体片段能够存在于切除后的基因组细胞中，这可能会影响细胞功能33。人们又发现利用如piggy Bac(PB)转座子等可移动的基因元件来传递外源多能性基因非常有效，且PB转座系统具有转座效率高、删除精到准确等优点34。此方式方法通过短暂的转位表示出，能够从重新编程的细胞中完全去除该元件的残存余留35。不幸的是，人类基因组中有内源性的类PB转座子元件，在转基因切除后会引起非特异性的基因组改变36。为克制PB转座子的局限性，人们又引入了Sleeping Beauty(SB)系统，使其整合频率低于PB转座子，并且人类基因组中没有类SB元件37。然而这又导致了新的问题：此方式方法的重编程效率很低，使用可切除的元件还可能会导致重新整合的风险33。 1.2.3、 非整合病毒载体转移系统的重编程 Stadtfeld等38利用腺病毒等非整合病毒载体成功地建立了人和小鼠i PSCs，从这些研究中获得的i PSCs显示在宿主基因组中没有外源DNA的插入。然而，当前的非整合病毒载体传递方式方法的重编程效率仅限于0.001%，因而有人以为OSKM的瞬时表示出缺乏以产生完全的表观遗传重塑14,36。尽管如此，腺病毒方式方法在转化医学中的应用仍有很大的前景24。另一种方式方法是使用负单链RNA仙台病毒(Sendaivirus,Se-V)，由于它在很多类型的细胞和组织中导入外源基因非常有效，但也碰到了低重编程效率的障碍39。尽管如此，人们仍在努力开发一种改进的Se-V40，由于Se-V在囊性纤维化基因治疗41和艾滋病疫苗42方面具有宏大的潜力，希望可用于人i PSCs的细胞替代治疗43。 1.2.4 、非整合非病毒载体转移系统的重编程 为了产生不含载体整合到染色体的i PSCs，能够使用细胞质RNA、附加体型载体(一种自我复制和选择的载体)44或多顺反子微环DNA非病毒载体系统45，将多潜能标记基因直接和瞬时地传递到体细胞中。这些方式方法相对容易使用，但重编程效率比LV低510倍24。因而，使用细胞质RNA和微环DNA载体需要广泛的优化以备将来的应用24。 小鼠和人成纤维细胞已成功地通过直接转移纯化的重编程蛋白46或从ESCs47、转基因HEK293细胞中分离的总蛋白48提取物进行重编程。然而这种方式方法存在一定的弊端，由于大量合成这样的蛋白质具有很大的挑战性，且转化效率十分低，细胞重编程经过需要8周。有实验室指出通过化学重编程产生i PSCs也许是可行的，但这一经过可能导致突变，由于细胞基因组易受DNA和组蛋白修饰14,33。引入合成RNA或编码重编程因子的信使RNA(m RNA)也许是建立无整合多能干细胞的有力平台，尽管这些方式方法可能需要多轮转染，但在生成具有更安全的i PSCs方面相对有优势49。 1.3、 提高重编程效率的方式方法 为了改良重编程经过，人们采用了诸如micro RNA(mi RNA)等新方式方法来提高重编程效率。例如，mi R-291-3p、mi R-294和mi R-295被用来代替c-Myc以产生均匀的hi PSCs集落50。除此之外，化学化合物如丙戊酸、丁酸钠和组蛋白脱乙酰酶抑制剂等已被证明能促进i PSCs的生成51,52,53。培养环境的改变，如缺氧培养也能提高重编程效率54。抑制p53途径55或抑制Nu RD(Mbd3/核小体重塑和去乙酰化抑制因子)复合物的组成成分Mbd3，都能够进一步促进i PSCs的生成56。卵母细胞中特异表示出的其他因子，如Glis1和H1foo，也能提高重编程效率57,58。 除了能够提高重编程效率，有些小分子在重编程经过中还能发挥部分OSKM转录因子的作用，甚至能完全代替OSKM转录因子将体细胞重编程为i PSCs。例如，使用组蛋白脱乙酰酶抑制剂和转化生长因子 抑制剂的培养基能够在没有c-Myc或Klf4的情况下提高i PSCs的生成，并且能够替代Oct4来维持细胞的多能性59。除此之外，用Aza(DNA甲基化抑制剂)和TSA(组蛋白脱乙酰酶抑制剂)诱导多能基因Oct4、Nanog、Sox2的表示出，能够将小鼠骨髓前体细胞(BPCs)重编程为i PSCs60。另一项研究报告表示清楚，尽管重编程效率较低，但转入mi RNA-302/367家族能够在没有转入OSKM转录因子的情况下成功地将小鼠和人类体细胞重编程为i PSCs61。Hou等62使用7种小分子化合物成功将小鼠体细胞重编程成i PSCs，且重编程效率高达0.2%。固然单用小分子对体细胞进行重编程在临床上有很大的应用价值，但由于重编程不完全，诱导后的多能干细胞容易恢复体细胞特征，这将限制小分子重编程在临床研究中的发展。 2 、基于i PSCs的疾病建模 2.1 、基因编辑技术 基于i PSCs的疾病模型的建立和使用通常包括下面步骤：收集来源患者的体细胞，通过重编程技术将其重编程成病人特异性i PSCs；利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术建立等基因对照(通常通过编辑已经知道疾病相关基因获得修复后的健康i PSCs)；将细胞分化为各种与疾病相关的特定细胞，并通过比拟患病和健康的特定细胞或类器官来定义疾病特异性表型；在分子水平上研究这些表型能够辨别新的病理机制，为药物发现和个性化治疗提供新的时机。i PSCs衍生的特定细胞和类器官在疾病建模、药物发现和细胞治疗中的应用如此图2所示。 快速发展的基因组编辑技术如今能够在特定位置将基因改变引入i PSCs，包括纠正患者来源的i PSCs中的致病基因突变以及将特定突变引入非疾病野生型i PSCs。这些方式方法提供以引入的突变作为唯一的变量来产生基因匹配的、等基因的i PS细胞系，确保了对真实病理的可靠鉴定，同时避免了由于可能的细胞系间变异导致的遗传背景差异或偶发现象的混淆。等基因i PSCs控制在模拟散发性或多基因疾病时尤其重要，由于这些疾病的表型差异很小63。 可编程位点特异性核酸酶的开发，包括锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)64,65、转录激活物样效应器核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)66,67和CRISPR/Cas9系统68，通过诱导基因修饰位点的DNA双链断裂，显着提高了人ESCs和i PSCs的基因编辑效率。华而不实CRISPR/Cas9技术由于设计简单、使用方便等优点，在人类胚胎干细胞和i PSCs的基因编辑中得到了广泛的应用。这种基因编辑技术允许研究人员将致病突变引入非患者i PSCs或消除患者i PSCs中的致病突变，进而开创建立基于i PSCs的疾病建模等基因控制平台。尽管使用CRISPR/Cas9技术可能会产生偏离目的的效果，如CRISPR/Cas9在肿瘤细胞系69中发现了相对较高水平的非靶基因修饰，但来自多个实验室的全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)研究表示清楚，非靶基因修饰在正常人类细胞(包括人i PSCs和ESCs)中很少见70,71。基因编辑工具也在不断改良和完善，这可能有助于解决脱靶效应的问题。最初CRISPR/Cas9通过诱导DNA双链断裂来编辑一个基因组位点；后来由成对向导RNA或特异性加强的工程化Cas9核酸酶变体(engineered Cas9 nuclease variants with enhanced specificity,e Sp Cas9)指导的Cas9核酸内切酶变体(D10A突变体)越来越多地用于基因组编辑72，由于这两种方式方法都能在保持对靶点的严格切割的同时显着降低了脱靶效应73。除此之外，催化死亡的Cas9 (dead Cas9,d Cas9)通过与转录激活剂或抑制因子融合，用于调节内源基因的转录或通过与荧光蛋白融合来成像基因组位点74。对CRISPR/Cas9系统的改造也能以精到准确的单等位或双等位基因的方式高效地引入DNA序列的变化75。近期在碱基编辑方面的一个新进展是利用CRISPR/Cas9与胞苷脱氨酶融合，使胞苷直接转化为尿苷而不需要双链DNA断裂76。这种新方式方法提高了基因编辑效率，并将进一步促进人类i PSCs的基因编辑发展。用于人类i PSCs的基因编辑技术以及作用机理如表1所示。 图2 来源于i PSCs的特定细胞和类器官在疾病建模、药物发现和细胞治疗中的应用 Fig.2 Application of specific cells and organoids derived from i PSCs in disease modeling,drug discovery and cell therapy 2.2 、传统二维细胞建模 辨别人类疾病的病理机制对于发现新的治疗策略具有关键作用。固然利用原代患者来源细胞建立疾病模型有助于研究人类疾病的病因和制定治疗策略，但一个关键的限制因素是无法获得可扩展的患者原代细胞，尤其是脑细胞和心脏细胞。人类i PSCs由于自我更新的内在特性和几乎能够分化为体内任何细胞类型的潜能而成为一个有吸引力的替代品，由于人类疾病(十分是那些有明确遗传原因的疾病)原则上能够使用容易获得的细胞类型(如皮肤成纤维细胞和血细胞)的i PSCs建模。患者特异性i PSCs能够提供大量与疾病相关的细胞和各种以前无法获得的细胞类型，如神经元和心肌细胞。除此之外，由于i PSCs能够从相关患者本身获得，因而它们能够使个性化疾病建模成为精准医学的核心部分。 基于i PSCs的疾病模型被广泛用于研究由单基因突变引起的疾病(单基因疾病)77，这种方式方法非常合适于此类疾病，由于i PSCs能够很容易地从这些疾病患者身上获得并分化成如神经元等与疾病相关的细胞。例如，从患者i PSCs中分化出来的神经元被用来模拟脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)，这是一种由SMN1基因突变引起的早发性疾病，SMN1基因突变导致运动神经元变性和随后的肌肉萎缩77。型SMA患者通常在出生后6个月出现异常感觉和状态，疾病进展迅速，在两岁时死亡78。在最初的基于i PSCs的疾病模型研究中77,i PSCs来源于型SMA患者的成纤维细胞，并分化为与疾病相关的细胞类型 运动神经元。与未受影响的对照组相比，患者i PSCs分化的运动神经元存活率降低。除此之外，来源于SMA患者的i PSCs能够对丙戊酸和妥布霉素(已经知道两种化合物能增加SMN蛋白的表示出量)产生反响，且这两种化合物能够提高SMA患者i PSCs的SMN蛋白水平77。这项研究提供了一个原则性的证据，病人来源的i PSCs能够用来模拟早发性遗传疾病，并可作为潜在的药物挑选平台。 表1 用于人类i PSCs的基因编辑技术 对发病较晚的疾病进行建模更具挑战性，由于从人类i PSCs分化出来的细胞通常表现出不成熟的表型。例如，理想情况下来源于i PSCs的心肌细胞在用于再生医学或药物发现时应该是成熟的，其成熟度将类似于成年心肌中心肌细胞的成熟度，进而使衍生细胞显示出类似的收缩性、电生理性能和对药物刺激的反响。然而，在现实中，i PSCs来源的心肌细胞是未成熟的，其形态特征等方面更符合胚胎状态下的心肌细胞79。未成熟心肌细胞较少显示有组织的肌节构造和钙处理机制，这些特征反映在成熟相关肌节基因(如MYL2、MYH7、TCAP和MYOM2)和离子转运相关基因(如KCNJ2和RYR2)的低表示出上80。研究人员已在诱导心肌细胞成熟方面做了很多努力：添加甲状腺激素81，长期培养82，用三维心肌组织中的机械调节结合电刺激83等方式方法都对i PSCs衍生心肌细胞的成熟有作用。除了要解决i PSCs衍生细胞不成熟表型的问题外，建模晚发性疾病更大的困难在于怎样诱导细胞衰老。对人i PSCs衍生的细胞进行诱导衰老的一种方式方法是用细胞应激源处理细胞，包括如吡咯菌素和MG-132等的靶向线粒体功能或蛋白质降解的化合物84；另一种诱导细胞衰老的方式方法是异位表示出如早衰蛋白等诱导早衰的基因产物85。然而，细胞应激源或早衰蛋白的表示出能否能通过一种类似于正常衰老的机制诱导细胞衰老仍有待确定。 i PSCs还为研究散发性疾病提供了一种新的方式方法(其病因尚未在患者的家族史或基因突变中确定)，这一点特别重要，由于很多疾病的大多数患者都属于散发性疾病。例如，在老年痴呆症中，95%的病人属于散发性疾病。研究人员通过对散发性阿尔茨海默病患者i PSCs衍生神经细胞的分析发现，一些散发性病例表现出与特定基因突变的家族性阿尔茨海默病一样的表型86，这表示清楚使用i PSCs也许能够对散发性疾病进行重新鉴定。然而，使用i PSCs对散发性疾病进行建模通常比单基因疾病更困难，由于这类疾病的表型变化是由多个小效应遗传风险变异体和环境因素共同诱导的。固然来源于此类疾病患者的i PSCs可能包含与疾病相关的风险变异体，但使用i PSCs来模拟此类疾病由于遗传和表观遗传背景的逐行变异而变得复杂，而且散发性疾病i PSCs的衍生细胞的表型估计比单基因疾病i PSCs的衍生细胞更为精细。因而，基于i PSCs的散发性疾病模型的一个关键问题是怎样产生仅在相关风险变异上存在差异的成对等基因细胞系63。利用CRISPR/Cas9技术产生基因编辑的等基因i PS细胞系的功能能够创造一个良好的控制系统，确保与疾病相关的基因风险变异体成为唯一的变量87。这种方式方法被用于产生帕金森病不同相关风险变异体的等基因i PS细胞系，结合等位基因特异性分析能够对该遗传风险变异体进行强有力的分辨和基因定位87。这一实验策略可用于研究与其他疾病相关的遗传危险因素。 除此之外，基于i PSCs的疾病模型也成为研究肿瘤疾病的发病机制和挑选新的治疗药物的有用工具。在不改变细胞基因组序列的情况下，来源于肿瘤疾病患者的任何细胞都能重编程成i PSCs，再分化为与对应肿瘤疾病相关的细胞类型，以此研究i PSCs向特异性肿瘤细胞转化的经过。例如，青少年骨髓单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia,JMML)是一种侵袭性骨髓增生性肿瘤，其发生的原因是突变导致细胞因子受体信号转导异常。将两名JMML患者的骨髓细胞和外周血细胞重编程成i PSCs，此i PSCs具有与患者体细胞一样的PTPN11基因的p.E76K错义突变，该突变体编码SHP-2 (一种非受体酪氨酸磷酸酶)88。与正常i PSCs体外分化产生的髓系细胞相比，JMML-i PSCs衍生的髓系细胞增殖能力加强、粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)被激活且STAT5/ERK磷酸化加强，这些特征与JMML患者的原代髓系细胞类似，且MEK激酶的药理抑制作用能降低JMML-i PSCs衍生的髓系细胞GM-CSF的活性88。这项研究表示清楚i PSCs衍生细胞在人类原发性恶性肿瘤体外建模中的效用，为该疾病潜在的靶向治疗提供理论根据。基于i PSCs的疾病建模在遗传性肿瘤疾病的研究中也展示出宏大的前景。Li-Fraumeni综合征(Li-Fraumeni syndrome,LFS)是一种常见的由p53基因突变引起的恶性肿瘤综合征89。来源于LFS患者的i PSCs衍生的成骨细胞显示出分化缺陷性和致瘤性,且H19基因的表示出受阻，这些特征与骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞一致。恢复LFS-i PSCs中H19的表示出促进了成骨细胞的分化并抑制了其致瘤性90。该研究结果证明了用i PSCs研究遗传性人类肿瘤疾病的可行性。 2.3 、类器官：培养皿里的复杂组织 i PSCs衍生产品的临床应用在很大程度上依靠于定向分化、细胞状态转换和组织工程的最新技术。早期利用i PSCs定向分化的研究经常利用单基因疾病中的细胞水平表型，但转化为组织水平和器官水平的疾病需要开发更复杂的3D多细胞系统。随着i PSCs衍生类器官的发展，i PSCs在疾病建模方面获得了重要进展91。类器官是由干细胞分化而来的三维多细胞聚集体，能够自我组织，能够表现成熟组织的构造特征和细胞间的互相作用92。用于指导类器官与i PSCs分化的可溶性生物物理学方式方法已逐步完善，以产生越来越复杂的 人造组织 91。患者来源的i PSCs和基因纠正的i PSCs平行分化成类器官，能够将类器官水平的疾病表型归因于特定的分子病变。一旦建立了清楚明晰的类器官水平研究平台，病变的类器官就能够用于药物挑选和验证研究。 早期的ESCs和i PSCs研究利用神经分化方式方法来模拟神经系统疾病93。从人i PSCs衍生的3D大脑类器官的开创建立就是建立在这些基本的神经分化方式方法的基础上，但随后要在悬浮生物反响器中生长长达70天，另外这些3D大脑类器官还给研究人员带来形态建成的启发线索94。这些器官包含脑皮层组织区域以及特定前脑和后脑区域的功能性神经元，甚至包含未成熟视网膜和脉络丛的分化构造94。Quadrato和Sloan等95,96对3D大脑类器官培养方式方法的改良还能诱导3D类器官构成大脑中的海马体和小脑等特定区域构造，以及诱导构成皮层折叠构造。神经类器官由于显着的复杂性而被用来模拟各种单基因和多基因神经系统疾病，这些疾病的研究为神经疾病的病理生物学提供了深切厚重的基础。例如，CDK5RAP2编码一种中心体蛋白，该蛋白在有丝分裂经过中定位于纺锤体极，而CDK5RAP2基因的复合杂合子突变将引起小头畸形。CDK5RAP2基因突变患者i PSCs衍生的神经类器官最初被用来模拟小头畸形，由此发现患者特有的神经类器官经历了神经上皮早期分化，并显示出异常的径向胶质取向和较小的分化神经组织区域94。而另一种编码中心体蛋白的CENPJ基因在微管组装和成核的调节中起重要作用，CENPJ的突变将引起小头综合征，该病患者i PSCs衍生的神经类器官中也观察到类似的表型97。近年来，来源于人i PSCs的神经类器官还被用作研究脑肿瘤的平台，研究人员使用含有神经干细胞和前体细胞的大脑类器官，通过载体转化以引入常见于脑肿瘤的突变，然后研究突变后细胞的过度生长问题以模拟脑瘤的发生和发展98。因而，与2D系统相比，神经类器官的研究让人们加强了对神经系统疾病病理生物学的了解。 在从i PSCs生成肝细胞治疗各种肝脏疾病方面的二维分化方案已被证明是有效的99。近期，在三维类器官系统中，从患有肝胆疾病的i PSCs中已经衍生出胆管细胞。当前的分化方案是首先定向分化为内皮细胞和肝母细胞，然后在三维培养中分化为胆管细胞样细胞100,101。这些胆管细胞类器官能够流出胆汁酸并具有功能性分泌作用，进而能够模拟Alagille综合征，这是一种由于Notch信号中断而导致胆管构成受损的疾病101。在与多囊性肝病患者分化的胆管细胞类器官中，合成生长抑素类似物奥曲肽降低了类器官的大小，与该药物在治疗患者多囊性肝肿大中的作用一致101。携带F508del突变的多囊性肝病和囊性纤维化(CF)患者的i PSCs衍生的胆管细胞类器官显示出氯化物转运受损和CFTR蛋白表示出量降低，而CF校正药物VX809能稳定该类器官中CFTR蛋白的表示出，与该药物在囊性纤维化患者中的作用一致100,101。在每一个病例中，复杂疾病表型的建模都是通过三维类器官的发展而实现的。 近年来，心脏类器官的研究获得了极大的进展。i PSCs衍生的心脏类器官具有胎儿样分化的特点，虽已被用于心肌细胞损伤后再生的模型研究，但是这一发现强化了一种观点，即来源于i PSCs的心肌细胞和其他组织经常表现出胎儿样分化，这可能会阻碍成人疾病的建模102,103。近期有研究者产生了具有中心空腔的复杂心肌细胞类器官，这让分化方案逐步完善104。除此之外，i PSCs已经被用于构建三维心肌组织，以评估机械力、代谢和细胞外基质对心肌细胞成熟的影响，这些研究包括使用i PSCs的组织工程的各个方面105。研究人员还通过3D器官芯片技术将i PSCs用于模拟心肌病，这一策略被应用在很多其他疾病系统中，为模拟血管灌注提供了额外的理论支持106,107。 近期的两项研究强调了人i PSCs衍生的肺类器官在疾病建模中的作用108,109，方式方法是将人i PSCs定向分化为NKX2-1+的气道祖细胞，该祖细胞能够随后构成近端或远端气道细胞108。在低Wnt激活的三维培养中，NKX2-1+祖细胞可重复构成包含各种近端气道细胞的类器官，包括分泌细胞、杯状细胞和基底细胞108。用forskolin同时处理来自囊性纤维化F508del-CFTR突变纯合子患者和来自对照的健康人类的i PSCs衍生的近端气道类器官，相比之下，患者衍生的类器官显示forskolin诱导的肿胀受损108。研究人员将这一表型归因于CFTR功能障碍，而后i PSCs中F508del的基因纠正改善了forskolin诱导的肿胀108，进而揭示了基因编辑在i PSCs疾病模型中确认的基因型-表型关系。人i PSCs来源的NKX2-1+肺祖细胞在3D培养中也能分化为远侧肺泡类器官，这些肺泡类器官含有功能性的2型肺泡上皮细胞，这些细胞含有板层小体并分泌外表活性蛋白。而来自缺乏外表活性蛋白B (SFTPB)患者的i PSCs，其衍生的肺泡类器官固然含有2型肺泡上皮细胞，但这些细胞缺少板层小体或不能合成SFTPB109。以上研究结果表示清楚通过基因编辑来纠正SFTPB突变也许能改变该疾病患者i PSCs衍生细胞的表型。 2.4、 人 动物嵌合体 尽管基于类器官的疾病模型在复杂性、成熟度和细胞多样性方面有所拓展，但还是局限于组织培养，限制了与体内循环、神经和免疫系统、激素以及其他代谢介质互相作用的探寻求索110。除此之外，类器官还缺少体内存在的很多形态发生信号92。例如，在模拟血液疾病时，体外分化系统很少将微环境因子纳入造血分化和造血干细胞(HSCs)的研究中111,112。近年来，细胞和类器官异种移植与人i PSCs的研究进展已经克制了这些局限性。鉴于近期很多细胞治疗的临床研究案例呈爆炸性增长之势，而基于i PSCs的异种移植嵌合体疾病模型已经能够愈加忠实地模拟人类疾病并成为推动这些研究进展的可靠工具。 人类神经组织的异种移植已经用于研究人类疾病几十年了，人胚胎干细胞的分离培养、i PSCs技术的发展、人胚胎干细胞的神经分化倾向以及移植模型生物，都为细胞治疗提供了一种新型的治疗技术113。当人类i PSCs分化的神经元异种移植到发育中的小鼠脑中时能够整合、构成功能性突触并整合到神经回路中114。i PSCs分化的内源性神经干细胞(NSCs)在大鼠脑内植入后