临床免疫学检验-ppt课件-第20章-临床免疫检验的质量保证.pptx

第二十章第二十章 临床免疫检验的质量保临床免疫检验的质量保证证目 录第一节 基本概念第二节 临床免疫学检验的技术特点第三节 分析前质量保证第四节 分析中质量保证第五节 分析后质量保证第一节第一节 基本概念基本概念重点提示质量保证：临床实验室为证明提供患者临床诊疗或临床实验研究数据的有效性，采取一系列有效的措施，包括分析前、分析中和分析后的三个过程。分析前、分析中和分析后的三个过程。敏感性:实际患病正确判断为阳性（真阳性）的百分率。公式=TP/TP+FN TP=真阳性 FN=假阴性 如TP=85，FN=15，敏感性=85/(85+15)=85%特异性:实际无病者正确判断为真阴性的百分率。公式=TN/TN+FP TN=真阴性 FP=假阳性 如TN=85，FP=15，敏感性=85/(85+15)=85%阳性预测值(PPV):特定试验方法测定得到的阳性结果（包括假阳性）中真阳性的百分率。公式=TP/TP+FP TP=真阳性 FP=假阳性 如TP=85，FP=15，PPV=85/(85+15)=85%阴性预测值(NPV):特定试验方法测定得到的阴性结果（包括假阴性）中真阴性的百分率。公式=TN/TN+FN TP=真阳性 FP=假阳性 如TN=85，FN=15，NPV=85/(85+15)=85%精密度:各个独立测定结果间的一致性程度。用SD及CV表示准确度：待测物与真实值得一致程度。室内质量控制:由实验室工作人员采取一定方法和步骤。连续评价本实验室工作的可靠程度。主要检查精密度。室间质量评价：客观比较某一实验室的测定结果与靶值得差异，由外单位采取一定方法，连续客观评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室间的结果就有可比性。第二第二节节 临床免疫学临床免疫学检验的技术特点检验的技术特点重点提示阳性反应判断值的设定临床预测值根据阳性预测值对免疫测定方法的分类：筛查试验；诊断试验；确认试验一、阳性反应判断值的设定在大部分的免疫测定中，阳性人群标本检测值的范围与阴性人群标本检测值的范围往往会存在部分的重叠，因此为了判断定性免疫测定的结果，需要设定判断阴性或阳性结果的阳性反应判断值(cut-off value)。需根据三组人群综合考虑：患该病人群、健康人群及患其他疾病人群。1.为得到较高的PPV,阳性反应判断值可能大大高于测定下限。如ELISA试验测定丙肝病毒时，丙肝病毒在正常人群出现较高的阳性反应结果，因此阳性结果判断值常远高于测定下限。2.阳性反应判断值依人群及年龄而不同。3.阳性反应判断值判断结果，假阳性和假阴性不可避免。因此需进一步确认。如HIV诊断二、临床预测值 结结 果果 50%感染率感染率 30%感染率感染率 10%感染率感染率 1%感染率感染率 0.5%感染率感染率 检出(+)未检出()检出(+)未检出()检出(+)未检出()检出(+)未检出()检出(+)未检出()+49,500 50029,700 300 9,900 100 990 10 495 5 50049,500 70069,300 900 89,100 990 98,010 99598,505敏感性(TP/TP+FN)99%99%99%99%99%特异性(TN/TN+FP)99%99%99%99%99%阳性预示值TP/TP+FP49500/49500+500=99.0%29700/29700+700=94.6%9900/9900+900=91.67%990/990+990=50%495/495+995=33.2%阴性预示值TN/TN+FN49500/49500+500=99.0%69300/69300+300=99.6%89100/89100+100=99.89%98010/98010+10=99.99%98505/98505+5=99.99%需根据三组人群综合考虑：临床预测值与特定感染性疾病在某一人群中的流行率直接相关。如一个具有敏感性和特异性的检验方法在流行率为10%的人群中，其PPV为67.9%，而在流行率为1%的人群中，其PPV低至16%。在临床上对怀疑某种疾病的患者进行检测，则PPV大大提高，相反，对所有常规就诊者，则PPV很低。三、根据阳性预测值对免疫测定方法的分类筛查试验(screening tests)用于检测整个人群或部分人群中抗原或抗体的存在情况。一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑，例如假阳性结果是否会对被检测人经济或心理上产生严重的不良影响、对误诊病例的治疗是否会产生严重的后果（例如，由于风疹抗体水平较高，而怀疑妊娠期感染，为避免感染造成的不良后果，需要进行流产手术以终止妊娠）、是否有可以对阳性筛查结果进行确认的方法、确认是否易于执行、确认方法是否价格昂贵等。通常情况下，筛查试验结果阴性提示被检测人待测物阴性的可能性很高，而筛查试验结果阳性仅提示阳性结果的可能，但需要进一步的确认。诊断试验诊断试验诊断试验 (diagnostic tests)(diagnostic tests)用于检测临床上已怀疑某种疾病的患者中抗原或抗体的存在情况。如果待测的抗原或抗体对于治疗以及判断预后有重要意义，则该诊断试验应当具有足够高的敏感性。如果试验的结果可以很容易地通过确认试验进行确认，且确认试验的准确性高，那么对诊断试验的特异性要求可适当降低。确认试验确认试验（确认试验（confirmatory testsconfirmatory tests）用于对筛查试验或者诊断试验结果的确认。对于确认试验，特异性和阳性预测值比敏感性和阴性预测值更为重要，确认试验的特异性应当大于99%。确认试验可以是免疫测定，也可以是培养或核酸检测。一般来说，可以作为确认试验的免疫测定方法有免疫印迹试验、重组免疫印迹、抗体中和试验等，但这些方法不一定就是确认试验，这取决于试剂的特异性是否足够高。如果诊断试验本身的特异性和阳性预测值就很高，那么就没有必要再使用确认试验进行结果的确认。第三第三节节 分析分析前质量保证前质量保证分析前质量保证分析前质量保证检验项目的申请患者的准备标本的采集标本的运送标本的接收标本的保存血清中影响检测结果的常见内源性干扰因素一、检验项目的申请（二）检验项目的申请原则临床医生根据疾病的诊疗需要选择合适的检验项目，保证项目的有效性、及时性和经济性。临床上绝大多数免疫学方法仅能作为筛查或诊断试验，也存在一定比例的假阳性，因此只能用于辅助诊断。如有肝炎的患者，可申请做肝炎全套检测；对正常人，阳性结果不能用于诊断，需进一步确认。（二）申请单格式和填写受检者的唯一标识（姓名、年龄、科别、病房、门诊号/住院号）、临床诊断或疑似诊断、标本类型、检验项目、送检日期（年、月、日）、标本采集时间和接收时间；收费/记账及检验号。（二）申请单格式和填写受检者的唯一标识（姓名、年龄、科别、病房、门诊号/住院号）、临床诊断或疑似诊断、标本类型、检验项目、送检日期（年、月、日）、标本采集时间和接收时间；收费/记账及检验号。（三）申请检验项目的时间患者处于疾病感染的窗口期，抗原抗体无法检测病毒感染IgM 升高在早期IgG在感染早期和恢复期，需采双份血清，过早或过晚可能导致阴性结果。生物素-亲和素系统检测时，使用5mg/d生物素治疗，至少用药8小时才能采样 二、患者的准备（一）标本采集（一）标本采集确定患者的身份，核实患者的姓名、性别、住院号等信息。不清醒者，找家属或医护人员加以确认三 标本的采集最常用的标本：血液，包括血清、血浆和全血，也可用唾液或尿液。尿液标本，需采集“中段尿”。建议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。采集容器最好为一次性无菌密闭容器对激素如可的松在早晨4:00-6:00，会出现一峰值，从卧位到站位，血清中肾素活性增高；激素和治疗药物、感染性病原体、抗原、抗体、肿瘤标志物、特定蛋白等，无时间和体位的要求。四 标本的运送运送过程需密闭、防震、防漏和防污染。特殊标本如胰岛素、C肽等需冰盒送检五 标本的接收1.标本的溶血：避免严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，有类似过氧化氢酶活性，在ELISA如血清中血红蛋白浓度过高，易吸附于固相，从而与加入的HRP底物反应显色，产生假阳性或阴性。2.细菌的污染一是分泌的酶能分解抗原抗体等蛋白二是细菌的内源性酶对测定方法的酶标记物有干扰作用六 标本的保存标本接收后，应立即进行检测如不能立即检测，血清标本分离血清后可28保存一周，如为无菌操作，建议-20保存七 血清中影响检测结果的内源性干扰因素1.RF RF具有与变性IgG产生非特异性结合的特点，在ELISA中，可与固相包被的IgG-RF-酶标特异IgG抗体，出现假阳性结果，尤其在捕获法IgM性抗体表现尤为典型。2.补体在固相抗体及酶标二抗均有激活人补体的功能。一是它们在吸附过程中，抗体分子结构改变，激活C1q,将两者桥联，导致假阳性结果；另一方面固相抗体也因活化补体的结合，封闭抗体的抗原结合能力，导致引起假阴性结果3.嗜异性抗体在人类血清中含有抗啮齿类动物（如鼠、马及羊）的免疫球蛋白抗体，一般结合在Fab段，可通过交联固相和酶标的单抗或多抗出现假阳性反应。4.自身抗体自身抗体如抗甲状腺球蛋白抗体、抗胰岛素抗体等，能与相应的靶抗原结合，干扰ELSIA抗原的测定5.溶菌酶:与等电点较低的蛋白质有较强的结合能力，在双抗体夹心法仲，可与固相的IgG和酶标的IgG形成桥联，从而导致假阳性。第四节第四节 分析分析中的质量保证中的质量保证重点提示重点提示实验室环境条件仪器设备维护校准试剂方法的性能验证标准操作程序的建立人员培训标本前处理室内质量控制室间质量评价或实验室间比对一 实验室环境条件空间充分合理的空间良好的照明空调设备二、仪器设备维护校准温度湿度不只是为了仪器设备运行抗原抗体结合反应与环境温度和湿度均有关系实验室仪器设备及管理加样器：维护、校准荧光显微镜：维护、校准水浴箱：维护、校准酶标仪：维护、校准洗板机：维护离心机：维护生物安全柜：维护冰箱：维护三 试剂方法的性能验证精密度或重复性（定性和定量）：定性测定时不能使用强阳性或阴性标本，只能使用接近临界浓度的标本；定量测定时通过标准差和变异系数来评估准确度（定性和定量）:定性时将待验证方法与公认（金标准或参考方法），比较两种方法之间结果的差异性，一般用阳性或阴性符合率来评价（要求95%以上）；定量评价测定结果与真实结果的差异线性（定量）可报告范围（定量）检出限（定性）：是指被检体系重复检测出待测物质的最低浓度水平。如采用浓度为检测下限的标本检测至少20次，如产生95%的阳性结果，则验证通过参考区间（定量）;划分正常或异常人群。一般有厂家或方法建立者提供抗干扰能力（定性和定量）四 标准操作程序的建立需要将每个操作步骤标准化，并形成标准操作程序。最重要的是在测定中，所有的实验技术人员在进行相关测定时，必须严格按相应的SOP进行操作，除非经实际工作证明正在使用的SOP中有不适当之处时，才可对SOP按一定程序进行修改。五 人员培训实验人员需具有一定的专业技术知识和经验，包括检测技术的基本原理、实验操作、仪器设备的使用、维护和保养、质量保证、质量控制、生物安全、结果的报告和解释等。从实际工作来看，不同的操作者所得到的测定结果，往往差异很大。因此人员的培训非常重要，应根据实际工作的需要，建立定期培训计划。六 标本前处理血液采集后，如收集管中无促凝剂或抗凝剂，则血液通常在半小时后开始凝固，18小时24小时完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时分离出的血清仍残留部分纤维蛋白原，易造成假阳性结果。因此，血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。七 室内质量控制统计室内质量控制方法非统计室内质量控制方法Levey-Jennings质控图方法也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。Levey-Jennings质控图方法Levey-Jennings质控图方法统计学含义1.2s为告警限，3s为失控限，稳定条件下，在20次结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。2.在每批病人标本测定的同时测定质控品，将所得结果标在质控图上，质控品在控时，方能报告该批病人标本的测定结果，质控品失控时，说明测定过程存在问题，不能报告病人标本结果，应解决存在的问题，并重新测定在控后方能报告3.当使用一个以上浓度的质控品想在同一张质控图描点时，则质控图上均值和s可不标具体数据如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。4.若以均值2s为失控限，假失控的概率太高，通常不能接受；以均值3s为失控限，假失控的概率低，但误差检出能力不强阳性率的统计室内质量控制方法按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被称为小概率事件，即发生的可能性很小。当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在，有必要对其发生的原因进行分析。对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于5%时，则可判为失控。根据二项式分布的概率计算如在一个实验室中某检测结果的阳性率为p，计算在n个患者样本中有m个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算公式如下：Pm=Pm5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。根据二项式分布的概率计算如果一个实验室检测HBsAg，平常病人结果的阳性率为10%，即p=0.1,在某一次检测19个样本出现5个阳性结果，14个阴性结果，则检测过程中是否存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在19个样本中出现至少5个阳性结果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4个阳性结果的概率）即：1P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=10.919+19(0.9)18(0.1)+171(0.9)17(0.1)2+969(0.9)16(0.1)3+3 876(0.9)15(0.1)4=0.035说明在该实验室19个标本中获得5个或5个以上阳性结果的概率为3.5%，属于小概率事件，结果失控，有假阳性结果的可能。非统计室内质量控制方法在检测临床标本的同时，检测靶抗原或抗体接近试剂测定下限的质控品，并与临床标本的测定同时进行，以判断检测的有效性。检测结果为阳性，则质控品在控。适用于定性和半定量免疫检验，如沉淀试验、凝集试验、荧光免疫试验、固相膜免疫分析技术或非定量的酶免疫试验和化学发光免疫试验等。抗核抗体荧光免疫试验室内质控品1:1001:1601:3201:6401:1000弱阳性样本弱阳性样本较强阳性样本较强阳性样本室内质控品的基本条件1.基质与待测标本一致,如标本为血清，质控品也应为血清2.室内质控品要求其所含待测物的浓度接近试验或临床决定性水平（对定性试验来说，是指特定试验的检验下限，即特定试剂的阳性反应判断值，更能灵敏反应常规测定中批间变异；对定量测定来说，反映具有临床诊疗价值3.良好的稳定性4.靶值或预期结果已定;室内质控品浓度接近试验的决定水平，其靶值或预期结果是已知的5.无已知的传染危险性：经血液传播的病原体如HIV、HCV和HBV等必须做灭活处理6.单批可大量获得7.价廉失控后的常见原因1.测定操作中的随机误差2.仪器的问题3.试剂的问题4.室内质控品失效（二）室内质控的局限性可确保实验室室内测定质量的一致性，确保临床测定过程及结果在精密度方面达到预定的标准。但不能保证在单个的测定样本中不出现误差。比如标本吸取错误、结果记录错误等。八 室间质量评价为客观地比较某一实验室的测定结果与靶值的差异，由外单位机构，采取一定的方法，连续、客观地评价实验室的结果，发现误差并校正结果，使各实验室之间的结果具有可比性。是对实验室操作和实验方法的回顾性评价，而不是用来决定实时的测定结果的可接受性。通过参与EQA，实验室可对自己的实验操作进行纠正，从而起到自我教育的作用。第五节第五节 分析后的分析后的质量保证质量保证重点提示重点提示结果的报告与解释检验后标本的保存与处理咨询服务结果的报告基本信息患者的姓名、性别、年龄；送检科室或单位名称；标本采集时间和实验室接收标本时间；标本的编号或条码；检测项目；标本类型；检测方法和主要设备等。结果的报告筛查试验或诊断试验的阳性结果应当报告为“反应性”或“阳性反应”。如未发生抗原抗体的反应，则报告为“阴性”。确认试验的结果可直接报告“阳性”或“阴性”。结果的报告将检测结果对应检测项目的名称，列在报告单上。定量检测应注明项目的参考区间或检测方法的线性或测定范围；定性检测筛查试验或诊断试验报告“反应性”（阳性反应）或“阴性”，确认试验的结果报告“阳性”或“阴性”，并提供报告结果的测定范围。检测人、审核人、复核人签字，结果报告日期和备注。结果的解释需清楚说明结果对疾病的诊断意义，即指出该检测结果提示疾病的可能性。说明在何种情况下有可能为假阳性或假阴性结果。排除假阳性或假阴性结果的方法（进一步检测或追踪）。如果已在进行进一步的检测，应在报告中予以说明。临床解释的责任属于临床医生，临床医生通过综合患者临床信息解释结果和其他检测结果来对特定的免疫测定结果作出最终解释。检验后标本的保存与处理检验后标本的保存检验后标本的检索检验后标本的处理咨询服务咨询服务的提供与临床的沟通本章小结由于免疫学检验的原理主要是抗原抗体的相互作用，阳性反应判断值的设定决定了免疫测定存在假阳性和假阴性的可能。对于临床而言，免疫测定方法的临床预测值是最为重要的参数。根据阳性预测值的高低，可将免疫测定方法分为筛查试验、诊断试验和确认试验三种。临床上绝大部分开展的免疫学检验，都是仅能作为筛查试验或诊断试验，阳性结果仅代表在检测中发生了抗原抗体的阳性反应，但阳性反应可能是真阳性，也可能是假阳性，也就是说存在一定比例的假阳性可能。由于免疫检验方法学的这一局限性，在免疫检验的分析前、分析中和分析后质量保证中，都涉及到与其他检验项目不同的特点，突出表现在检验项目的申请（分析前）和结果的报告与解释（分析后）两个方面。本章小结本章小结分析前质量保证包括检验项目的申请、患者的准备、标本的采集、运送、接收和保存等。分析中的质量保证包括实验室环境条件、仪器设备维护校准、试剂方法的性能验证、标准操作程序的建立、人员培训、标本前处理、室内质量控制、室间质量评价和实验室间比对等，其中室内质量控制和室间质量评价是质量保证的重要方面。分析后的质量保证包括结果的报告与解释、检验后标本的保存与处理和咨询服务等方面。复习思考题1.简述Levey-Jenning 质控图方法的主要特点。2.简述理想的室内质控品应具备的特征3.简述免疫检验室内质量控制常见的失控原因1.室内质量控制的用途包括（）A.可以用来监测方法或检测系统的准确性B.可以评价检验结果的精密度C.可以用来比较某一实验室的测定结果与靶值得差异D.可以提高实验室常规工作中批内、批间样本检验的一致性E.可以使实验室间的结果具有可比性 2.下述对阳性反应判断值的描述正确的是（）A.免疫测定中，检测结果大于阳性反应判断值可确认为阳性B.相同检测试剂的阳性反应判断值依人群及年龄的不同可能会有所差异C.根据阳性反应判断值进行结果的判定，可完全避免假阴性和假阳性结果D.通常根据患有该疾病的人群来设定阳性反应判断值E.阳性反应判断值等同于测定下限 3.以下对Levey-Jennings 质控图方法的描述中，错误的是（）A.属于阳性质控标本测定重复性的统计室内质量控制方法B.需要先进行基线测定C.所谓基线测定是首先使用质控品确定实验在最佳条件下和常规条件下的变异D.如果在30次室内质控控制结果中出现1个结果超过2SD，说明质控品失效E.通常以2SD为告警限，3SD为失控限判断 质控限 4.下列是理想免疫检验室内质量控制品的条件，除了（）A.稳定 B.所含待测物的浓度接近试验临或临床决定水平C.对靶值确定的准确性有严格的要求D.无生物的传染威胁性E.基质对测定结果无影响THANK YOU!THANK YOU!