分子生物学(余爱丽)第五章dna的损伤、修复和突变.ppt

第五章第五章DNA损伤、修复损伤、修复和突变和突变第四节第四节突变类型突变类型第五节第五节回复突变回复突变(抑制突变抑制突变)第六节第六节突变剂和突变生成突变剂和突变生成 概述：损伤因素及其类型概述：损伤因素及其类型 第一节第一节 复制过程中的错配修复复制过程中的错配修复 第二节第二节 损伤修复损伤修复 第三节第三节 限制和修饰限制和修饰 引起损伤的因素引起损伤的因素:自自发性性损伤(复制中的复制中的损伤、碱基的自、碱基的自发性化学改性化学改变、自自发脱碱基、脱碱基、细胞的代胞的代谢产物物对DNA的的损伤)物理因素引起的物理因素引起的损伤(电离离辐射、紫外射、紫外线)化学因素引起的化学因素引起的损伤（烷化化剂、碱基、碱基类似物）似物）引起引起损伤的的类型：型：碱基脱落、碱基（或核苷）改碱基脱落、碱基（或核苷）改变、错误碱基（碱基的取碱基（碱基的取 代）、碱基的插入或缺失、代）、碱基的插入或缺失、链的断裂、的断裂、链交交联（链内、内、链 间）、）、嘧啶二聚体等等二聚体等等 广义的修复系统：广义的修复系统：DNA聚合聚合酶的校的校对功能功能(复制的范畴复制的范畴)尿尿嘧啶-N-糖苷糖苷酶修复系修复系统 （复制复制时U的渗入、的渗入、C脱氨氧化成脱氨氧化成U）错配修复系配修复系统 损伤修复系修复系统(光复活、重光复活、重组修复、修复、SOS修复等修复等)限制修饰系统限制修饰系统-对付外源对付外源DNADNA的入侵的入侵第一节第一节复制过程中的错配复制过程中的错配的修复的修复DNAmismatch+-A-C-DNApol(=10-8)经第二次校正经第二次校正=10-11错配修复错配修复系统系统(MRSMismatchRepairSystem)1、错配修复碱基来源：、错配修复碱基来源：校正活性所漏校的碱基校正活性所漏校的碱基使复制的保真性提高使复制的保真性提高102103倍倍2、错配修复系统（、错配修复系统（Mismatchrepairsystem）DNApolymeraseHelicaseSSB外切核酸酶外切核酸酶(和和)连接酶连接酶MCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,SdamgeneDNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶甲基化酶)扫描新生链中错配碱基扫描新生链中错配碱基识别新生链中非识别新生链中非m6A的的GATC序列序列酶切含错配碱基的新生酶切含错配碱基的新生DNA区段区段（1 1）组成）组成 DNADNA合成过程中的甲基化变化合成过程中的甲基化变化DNA中的中的GATC(palindromicseq.)为为m6A甲基化敏感位点甲基化敏感位点平均每平均每2kb左右有一左右有一GATCseq.错配修复系统受甲基化的引导错配修复系统受甲基化的引导 甲基化程度的差异甲基化程度的差异a、MutH/MutS扫描识别错配扫描识别错配 碱基和邻近的碱基和邻近的GATC序列序列 切点甲基化切点甲基化GATC中中G的的5侧侧DNAhelicaseII,SSB,exonucleaseI去除包括错去除包括错 配碱基的片段配碱基的片段 DNApolymeraseIII和和DNAligase填充缺口填充缺口昂贵的代价用于保证昂贵的代价用于保证DNADNA的准确性的准确性（2 2）修复过程修复过程 外切核酸酶外切核酸酶切割切点的切割切点的55端（错配碱基在切点的端（错配碱基在切点的55端）端）-3-3端（端（-3-3端）端）3、尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶系统糖苷酶系统(ung system)修复尿嘧啶的来源：修复尿嘧啶的来源：dUTP的渗入的渗入胞嘧啶的自发脱氨氧化胞嘧啶的自发脱氨氧化-TAGC-ATCG-TAGC-ACG-U-TAGC-尿嘧啶尿嘧啶N糖基酶糖基酶GCUAU-TAGC-ACG-AP内切酶内切酶(Apurinase)-TAGC-ATCG-DNApolLigase 碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复 第二节第二节 DNA损伤的修复损伤的修复一、嘧啶二聚体的产生一、嘧啶二聚体的产生 类型：类型：TT二聚体二聚体（）、）、CC二聚体（二聚体（）、）、CT二聚体（二聚体（）TTCCCTTT二聚体二聚体TC二聚体二聚体CCCCCCCCPR1、光复活（、光复活（photoreactivation）-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA-复制前、不容易出错复制前、不容易出错400nm蓝光、蓝光、PR酶酶(photo-reactivationenzyme)光敏裂合酶（光敏裂合酶（photolyase）可见光激活可见光激活 二、二聚体修复的机制二、二聚体修复的机制2.切除修复切除修复ExisionRepair 复制前进行复制前进行不易出错不易出错UvrA,B,Cgene内切核酸酶内切核酸酶（Endonucleases）外切核酸酶外切核酸酶（Exonuclease）DNApolLigase 碱基切除修复碱基切除修复核核苷苷酸酸切切除除修修复复核苷酸切除修核苷酸切除修复复3.重组修复（重组修复（RecombinativeRepair）后复制修复、后复制修复、E.coli的挽回系统的挽回系统E.coli存活存活%U.V计量计量w.t.UvrA+RecA+uvra-reca-该该系系统统存存在在的的实实验验证证据据 Rec-A.gene 以某种方式参与以某种方式参与DNA损伤修复损伤修复 Rec修复系统比切除修复系统更有效修复系统比切除修复系统更有效 目前知道目前知道 Uvr系系统负责切除二聚体切除二聚体 Rec系系统负责消除没有被切除的二聚体消除没有被切除的二聚体 可能造成的后果可能造成的后果TTTTAAAATTTTTTTTAAAATTTT变性变性E.coli(Rec-A,uvr-a-)D.S.DNAS.S.DNAU.V.复制复制提取提取变性变性复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口二聚体后起始二聚体后起始 修复时期的证明修复时期的证明与与Rec-A蛋白引起的重组蛋白引起的重组(strandtransfer)有关有关TTdimer未被修复，仅表现在后代群体中未被修复，仅表现在后代群体中TTdimer浓度的稀释浓度的稀释链的非准确转移，导致突变机率的增加链的非准确转移，导致突变机率的增加重组修复相关机制重组修复相关机制:重组修复重组修复(链转移修复链转移修复)复制后修复复制后修复容易出错容易出错RecA,DNApolymeraeligase二聚体后起始二聚体后起始 RecA 聚合酶、连接酶聚合酶、连接酶重组修复后的损伤位点可重组修复后的损伤位点可由其它机制进一步修复由其它机制进一步修复4.易错修复（易错修复（SOS修复修复 SOS repair）E.coliE.coliE.coli 8010100mut.100%50%10%损坏的噬菌体损坏的噬菌体DNA在在E.coli A被修复被修复 E.coli的的SOS修复能被修复能被U.V.诱导诱导(A&B)SOS修复过程有非常高的突变频率修复过程有非常高的突变频率(易出错易出错)ABCUV 复活或复活或 W复活（复活（Jean Weigh）（1）实验证据实验证据（2）SOS修复机制修复机制SOS修复无模板指导的修复无模板指导的DNA复制复制大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生SOS系统诱导，错误潜伏的复系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行制超越二聚体而进行错误碱基错误碱基SOS修复只是修复只是SOS反应的一部分反应的一部分RecA在在SOS反应反应反应中起核心作用反应中起核心作用RecA与与LexA组成组成调控环路调控环路DNA 损伤损伤 SOS RecA RecA受受LexALexA的的部分抑制部分抑制RecA-P;三种功能三种功能a、DNA重组活性重组活性b、与与S.S.DNA结合活性结合活性c、少数蛋白的少数蛋白的proteinase活性活性当当DNA正常复制时正常复制时（无复制受阻，无（无复制受阻，无DNA损伤，损伤，无无TTdimer）RecA-p不表现不表现proteinase活性活性当当DNA复制受阻复制受阻/DNAdamaged细胞内原少量表达的细胞内原少量表达的RecA-p与与S.S,DNA结合结合激活激活RecA-p的的proteinase活性活性修复损伤修复损伤LexA-p降解降解RecA-p高效表达高效表达SOSopen当当DNA复制度过难关后复制度过难关后SOS repair 是一种错误倾向性极强的修复机制是一种错误倾向性极强的修复机制是进化中形成的是进化中形成的“竭尽全力，治病救人竭尽全力，治病救人”的措施的措施（正常状态下，（正常状态下，SOS是关闭的）是关闭的）RecA-p很快消失很快消失LexAgeneonSOSoff第三节第三节 限制和修饰限制和修饰 1、限制修饰现象限制修饰现象(restriction and modificaion)50年代初年代初 Luria（T偶数噬菌体）偶数噬菌体）Bertani（）Weigle（P2噬菌体）噬菌体）结论：结论：菌体限制修菌体限制修饰系系统中的限制性内切中的限制性内切酶能将外来能将外来DNA切断切断 菌体本身的菌体本身的DNA可受甲基化可受甲基化酶的保的保护 两者称两者称为限制限制-修修饰作用作用*E.coli K菌株和菌株和 B菌株各有自己的限制修菌株各有自己的限制修饰饰系系统统*E.coli C菌株没有菌株没有细菌借助于细菌借助于限制限制-修饰系统修饰系统来区别自己来区别自己DNA和外源和外源DNA 自己自己DNA:限制模式相同的限制模式相同的DNA 同株系的不同个体同株系的不同个体DNA、寄生于其中的质粒和噬菌体、寄生于其中的质粒和噬菌体 居民居民DNA(resident DNA)：同一个细胞内的不同类型的：同一个细胞内的不同类型的DNA，包括细胞包括细胞DNA，质粒，质粒DNA，噬菌体，噬菌体DNA等等 2、限制修饰系统、限制修饰系统 根据其特征分为两大组根据其特征分为两大组(三大类三大类)第四节第四节突变类型突变类型 染色体突染色体突变变（Chromosomemutation）chromosomenumber chromosomestructure 核苷酸突核苷酸突变变（dNtpointmutation）突变突变(mutation)：可以通过复制而遗传的：可以通过复制而遗传的DNA结构结构 的任何永久性改变的任何永久性改变遗传状态遗传状态 突变体突变体(mutant)：携带突变的生物个体或群体或株系：携带突变的生物个体或群体或株系 突变基因突变基因(mutantgene):含有突变位点的基因含有突变位点的基因野生型基因（野生型基因（wild type gene）：）：表示方法表示方法 表现型表现型 Lac+Lac-基因型基因型 lac+lac-或或 lac Z+lac Z-1、从、从突变作用来源上定义突变作用来源上定义自发突变自然界的突变剂或偶然复制错误自发突变自然界的突变剂或偶然复制错误诱变诱变人为使用突变剂人为使用突变剂 碱基异构式引起碱基异构式引起DNA复制过程的错误复制过程的错误-自发突自发突变变碱基异构式碱基异构式 A(amino氨基氨基)A(imino亚氨基亚氨基)C(a)C(i)G(keto酮式酮式)G(enol烯醇式烯醇式)G(k)G(e,i)T(keto)T(enol-2)orT(enol-4)碱基异构式引起碱基异构式引起DNA复制的错配复制的错配 G(k)C(a)正确配对正确配对A(a)T(k)错误配对错误配对G(k)T(e)A(a)C(i)A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn)A(i)C(a)G(e)T(k)A(a)T(k)A(a,anti)T(k,anti)C(i)C(a,anti)A(a)A(i,anti)碱基异构式引起碱基异构式引起DNA的错配突变的错配突变 C(i)C(a)G(k,syn)G(k,syn)G(k,anti)G(k)2、从序列改变多少上定义、从序列改变多少上定义 单点突变单点突变(point mutation)(点突变点突变)多点突变多点突变(multiple mutation)点突变碱基替代、碱基插入、碱基缺失点突变碱基替代、碱基插入、碱基缺失碱基替代（碱基替代（conversion）转换转换(transition)PyPy PuPu 颠换颠换(transvertion)PyPu 核苷酸缺失或插入核苷酸缺失或插入（dNtdeletionorinsertion）=3xdNt n+xAminoacid=3xdNt 移框（移框（Framshift）移框突变（移框突变（frameshift mutation）:一个或两个碱基的插入一个或两个碱基的插入 或缺失，或扁平碱性染料分子或缺失，或扁平碱性染料分子3、从对阅读框的影响上定义、从对阅读框的影响上定义移码突变移码突变Examples of deletion mutations 4、从对遗传信息的改变上定义、从对遗传信息的改变上定义（点突变）（点突变）同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子 错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变 （中性突变、渗漏突变）（中性突变、渗漏突变）无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变 为蛋白合成的终止密码子为蛋白合成的终止密码子碱基替代对遗传信息的改变碱基替代对遗传信息的改变-同义突变同义突变 GAAGAG Glu-错义突变错义突变 GAAAAA Lys-无义突变无义突变 GAATAA(stop)无义突变类型无义突变类型UAA（Oc）赭石型（赭石型（Ocher）UAG（Am）琥珀型（琥珀型（amber）UGA（Opal）乳石型（乳石型（Opal）5、从、从突变的表达类型突变的表达类型上定义上定义-非条件型突变非条件型突变:-条件型突变条件型突变:突变的表现突变的表现=突变基因型突变基因型+诱导条件诱导条件（光，温敏感不育）（光，温敏感不育）6、从突、从突变变效效应应上定上定义义正向突正向突变变:回复突回复突变变:使突使突变变体所失去的野生型性状得到恢复的第二次突体所失去的野生型性状得到恢复的第二次突变变真正的真正的原位回复原位回复突突变变很少很少大部分大部分为为第二点的回复突第二点的回复突变变抑制突抑制突变变7、突变位点存在于负责基因调控的序列中突变位点存在于负责基因调控的序列中*在启在启动动子区域子区域时时:启启动动子上升突子上升突变变:增增强强启启动动子子对转录对转录的的发动发动作用的突作用的突变变启启动动子下降突子下降突变变:*在操作子上或在操作子上或调节调节基因上基因上组组成型突成型突变变:产产生生组组成型表达方式的操作子突成型表达方式的操作子突变变或或调调节节基因的突基因的突变变突突变变的操作子不能被阻遏蛋白所的操作子不能被阻遏蛋白所识别识别调节调节基因突基因突变变不能不能产产生有活性的阻遏蛋白生有活性的阻遏蛋白两者之一都使两者之一都使结结构基因失去了构基因失去了负负向控制向控制第五节第五节回复突变回复突变(抑制突变抑制突变)1、抑制突变发生的部位、抑制突变发生的部位基因内抑制突变：抑制突变发生在正向突变的基因中基因内抑制突变：抑制突变发生在正向突变的基因中基因间抑制突变：抑制突变发生在正向突变基因外的其它基因间抑制突变：抑制突变发生在正向突变基因外的其它基因中基因中wildtypemutant(表现型表现型)正向突变正向突变(lowF.)回复突变回复突变(verylowF.正向的正向的110)间接抑制突变间接抑制突变:不恢复正向突变基因蛋白质产物的功能不恢复正向突变基因蛋白质产物的功能,而而是通过改变其它蛋白质的性质或表达水平是通过改变其它蛋白质的性质或表达水平而补偿原来突变造成的缺陷而补偿原来突变造成的缺陷,从而恢复野生型从而恢复野生型2、野生表型恢复作用的性、野生表型恢复作用的性质质直接抑制突变直接抑制突变:通过恢复或部分恢复原来突变基因产物蛋通过恢复或部分恢复原来突变基因产物蛋白质的功能而恢复野生表型白质的功能而恢复野生表型3、回复突变的分子机制回复突变的分子机制a)AGC(Ser)ACC(Thr)AGC(Ser)b)AGC(Ser)AGG(Arg)AGT(Ser)c)AGC(Ser)AGG(Arg)GGG(Gly)ifSer Gly（1）基因内抑制突变）基因内抑制突变(Intragenicsuppression)第二位点突变引起基因内校正第二位点突变引起基因内校正密码子间两次错义突变的互补密码子间两次错义突变的互补4、抑制突、抑制突变变的分子机制的分子机制错义突变错义突变移框突变移框突变错义突变错义突变造成野生型表型的丧失造成野生型表型的丧失部分原因部分原因在于影响到蛋白质的空间结构在于影响到蛋白质的空间结构(正负电荷、疏水作用正负电荷、疏水作用)a、静电作用、静电作用b、疏水作用、疏水作用移框突变的抑制突变移框突变的抑制突变(基因内第二点的插入或缺失基因内第二点的插入或缺失)（2）基因间的抑制突变）基因间的抑制突变无义突变无义突变-无义抑制突变无义抑制突变错义突变错义突变-错义抑制突变错义抑制突变移框突变移框突变-移框抑制突变移框抑制突变发生在发生在tRNA基因或与基因或与tRNA功能相关的基因上功能相关的基因上a、基因间的无义抑制突变（、基因间的无义抑制突变（Nonsense suppressor）野野生生型型UAG、UAA、UGA三种无义抑制三种无义抑制赭石型无义抑制赭石型无义抑制tRNA产生的几率很低，且抑制效率很低产生的几率很低，且抑制效率很低AGAUCUArgGlyGGACCUUCUGlyCCUGlyb、基因间的错义抑制突变、基因间的错义抑制突变(Missense suppressor)Glyc、基因间移框抑制突变、基因间移框抑制突变总结：基因内和基因间的错义（无义）、移框抑制突变均总结：基因内和基因间的错义（无义）、移框抑制突变均由相应的错义（无义）、移框突变抑制由相应的错义（无义）、移框突变抑制第六节第六节突变剂和突变生成突变剂和突变生成1、碱基类似物（碱基类似物（Baseanalog）2-氨基嘌呤氨基嘌呤(AP或或2-AP)2-Aminopurine5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(BrU)5-BromineUracilOOBrNH25-BrU:G:A 烯醇式烯醇式enolenolBrOHHOBr 酮式酮式KetoKetoHOAGCTTCCTATCGAAGGATAGCTBCCTATCGAAGGAT酮式5-BrU的渗入AGCTBCCTATCGAAGGATAGCTCCCTATCGAGGGAT第二轮复制ATGC转变转变AGCTBCCTATCGAGGGATAGCTTCCTATCGAAGGAT第一轮复制酮式到稀醇式的转变烯醇式渗入为烯醇式渗入为GCAT转变转变InDNABrU(k)BrU(e)(正常形式正常形式)(异构体异构体)BrU(k)BrU(e)难难易易AGGATCCT 碱基类似物产生的均为错义突变碱基类似物产生的均为错义突变 烯醇式烯醇式enolenolBrOHHOBr 酮式酮式KetoKetoHO:G:A2、碱基的化学修碱基的化学修饰导饰导致突致突变变又称化学突变剂：又称化学突变剂：亚硝酸（亚硝酸（nitrousacidHNO2）羟氨（羟氨（hydroxylamineHA）甲磺酸乙酯（甲磺酸乙酯（ethylmathanesulfonateEMS）N-甲基甲基-N-硝基硝基-N-亚硝基胍亚硝基胍（N-mathyl-N-nitro-N-nitrosoguanidionNNG）产生错义突变产生错义突变NH2OH(HydroxylamineHA羟胺羟胺)C(i)A(a)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOHNHHOHNHHON H3、嵌合剂的质突变作用、嵌合剂的质突变作用吖啶橙吖啶橙(Acridine Orange AO)扁平染料分子扁平染料分子溴化乙锭溴化乙锭(Ethidium Bromide EB)-ATTTTTCG-TAAAAAGC-ATTTCG-TAAAGC-TAOT-ATEBTTTTCG-TA分子插入分子插入AOEB-ATTTCG-TAAAGC-ATXTTTTCG-TAXAAAAGC-XAAAAGC-结果产生移框突变结果产生移框突变5、增变基因（增变基因（mutatorgene）w.t.维持遗传的稳定性维持遗传的稳定性mut.随机引起其他各类基因的突变随机引起其他各类基因的突变 一种误称一种误称4、转转座成分的致突座成分的致突变变作用作用生物体内有些基因与整个基因组的突变频率直接相关生物体内有些基因与整个基因组的突变频率直接相关其突变时，整个基因组的突变频率明显上升其突变时，整个基因组的突变频率明显上升增变基因类别：增变基因类别：a、DNApolymerase相关基因相关基因35校正功能突变校正功能突变b、错配修复系统的基因、错配修复系统的基因MCE(mismatchcorrectionenzyme)c、DNA损伤修复系统基因损伤修复系统基因错配，损伤修复功能丧失错配，损伤修复功能丧失突变率升高突变率升高6、紫外、紫外线线的致突的致突变变作用作用-嘧啶二聚体嘧啶二聚体(TTdimer)U.V.C T T A脱氨氧化脱氨氧化 U.V.CU A(a)U.V.U.V.H2O H+OH-C(a)C(i)A(a)脱嘌呤脱嘌呤造造成成的的突突变变：碱碱基基替替代代、缺缺失失、重重复复、移移框框7、突变热点（突变热点（Mutation Hotpoint）基因自发突变的频率是一定的基因自发突变的频率是一定的DNA分子上某些位点的突变频率大大平均数，分子上某些位点的突变频率大大平均数，这样的位点称为这样的位点称为a)重复序列重复序列（repetitiveseq.）/palindromicseq.e.g.Lac.Operon-CTGGCTGGCTGG-b)m5Cc)使用不同诱变剂出现的突变热点不同，转座子、紫外线也使用不同诱变剂出现的突变热点不同，转座子、紫外线也都有不同程度的序列优先性都有不同程度的序列优先性UCm5CT脱氨氧化脱氨氧化复制时，模板与新生链间滑动错配复制时，模板与新生链间滑动错配缺失，插入突变缺失，插入突变复制期发生在新生链上不发生突变，复制期发生在新生链上不发生突变，若发生在模板链上很快突变若发生在模板链上很快突变非复制期突变频率非复制期突变频率50DNA 的损伤修复与突变的损伤修复与突变Mutagen(诱变剂）诱变剂）完全修复完全修复DNA损伤损伤碱基的化学反应碱基的化学反应损伤的修复损伤的修复突变突变突变生成突变生成l l名词解释名词解释 移框突变移框突变 无义突变无义突变 错义突变错义突变 增变基因增变基因 组成型表达组成型表达 自己自己DNA DNA 组成型突变组成型突变 突变热点突变热点l l问答题：问答题：1 1、常见的无义、错义、移框突变的抑制突变的机制如何。、常见的无义、错义、移框突变的抑制突变的机制如何。2 2、mm5 5C C突变热点形成的原因。突变热点形成的原因。3 3、造成基因组成型表达的突变如何发生。、造成基因组成型表达的突变如何发生。4 4、错配修复酶的主要功能及作用机制。、错配修复酶的主要功能及作用机制。5 5、尿嘧啶、尿嘧啶N N糖苷酶系统修复碱基来源及修复机制。糖苷酶系统修复碱基来源及修复机制。6 6、核苷酸切除修复和重组修复的修复时期及简单过程。、核苷酸切除修复和重组修复的修复时期及简单过程。7 7、何为、何为RecARecA蛋白，其在蛋白，其在SOSSOS系统中有何用途？系统中有何用途？8 8、举例说明增变基因增加突变的原因？、举例说明增变基因增加突变的原因？本章结束本章结束!