环境工程微生物学十三 微生物学新技术在环境领域的应用.pptx

生物技术生物技术的的四大支柱四大支柱w酶工程：酶工程：即利用酶、细胞器或细胞具有的特异催化即利用酶、细胞器或细胞具有的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。艺过程来生产人类所需产品的一项技术。第1页/共176页酶工程的应用范围酶工程的应用范围（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中其中固定化酶技术固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。才真正得以体现。第2页/共176页w酶工程是生物技术的重要组成部分，具有酶工程是生物技术的重要组成部分，具有独特之处。独特之处。w酶技术以其高效率、低能耗、反应条件温酶技术以其高效率、低能耗、反应条件温和等优点在化工、医药、食品工业、轻工和等优点在化工、医药、食品工业、轻工业、石油化工产品的生产方面已得到成功业、石油化工产品的生产方面已得到成功应用，应用，环境工程环境工程技术方面的应用也将越来技术方面的应用也将越来越广泛。越广泛。第3页/共176页酶和酶技术与环保的关系酶和酶技术与环保的关系表现在三个层次表现在三个层次:1 1、在产品加工中用酶来替代化学品可以降低生、在产品加工中用酶来替代化学品可以降低生产活动的污染水平，有利于实现工艺过程生态产活动的污染水平，有利于实现工艺过程生态化或无废生产，真正实现化或无废生产，真正实现清洁生产清洁生产的目标。例的目标。例如纸浆漂白用如纸浆漂白用木聚糖酶、漆酶木聚糖酶、漆酶。2 2、酶作为、酶作为添加剂添加剂加入到产品中，使产品在使用加入到产品中，使产品在使用过程产生的污染大大减少，利于环保。例如饲过程产生的污染大大减少，利于环保。例如饲用用植酸酶植酸酶。3 3、直接应用酶与酶技术直接应用酶与酶技术进行污染物的降解和环进行污染物的降解和环境监测。例如境监测。例如脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等混等混合处理生活污水。合处理生活污水。第4页/共176页w早期的酶工程技术主要是从动物、植物、早期的酶工程技术主要是从动物、植物、微生物材料中提取、分离、纯化制造各种微生物材料中提取、分离、纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。等工业领域。w7070年代后年代后，酶的固定化技术取得了突破，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。第5页/共176页w随着第三代酶制剂的诞生，应用各种酶工程技随着第三代酶制剂的诞生，应用各种酶工程技术制造精细化工产品和医药用品及其在化学检术制造精细化工产品和医药用品及其在化学检测、测、环境保护环境保护等各个领域的有效应用，使酶工等各个领域的有效应用，使酶工程技术的产业化水平在现代生物技术领域中名程技术的产业化水平在现代生物技术领域中名列前茅，并正在与基因工程、细胞工程和发酵列前茅，并正在与基因工程、细胞工程和发酵工程融为一体，形成一个具有很大经济效益与工程融为一体，形成一个具有很大经济效益与社会效益的社会效益的新型工业门类新型工业门类。第6页/共176页酶工程技术的产业化酶工程技术的产业化w 1 1、新型抗生素生产工艺、新型抗生素生产工艺 抗生素工业是以青霉素的生产为开端的，迄今已有抗生素工业是以青霉素的生产为开端的，迄今已有5050多年的历史。多年的历史。7070年代开始，出现了一种新的生产工艺年代开始，出现了一种新的生产工艺酶法半合成酶法半合成。已用酶法生产的产品有头孢霉素。已用酶法生产的产品有头孢霉素I I号、号、号、羟头孢霉素、青霉素等。充分显示了酶法半合成作号、羟头孢霉素、青霉素等。充分显示了酶法半合成作为抗生素生产工艺的后起之秀具有巨大的竞争力。为抗生素生产工艺的后起之秀具有巨大的竞争力。第7页/共176页w2 2、用酶工程法制备新型甜味剂、用酶工程法制备新型甜味剂 传统的甜味剂主要是蔗糖与糖精。糖精被禁用后，蔗糖传统的甜味剂主要是蔗糖与糖精。糖精被禁用后，蔗糖就成了食品甜味剂的主角。就成了食品甜味剂的主角。19731973年，用年，用固定化葡萄糖异构固定化葡萄糖异构酶酶从葡萄糖生产从葡萄糖生产高果糖浆高果糖浆获得成功，产量迅速增加，目前获得成功，产量迅速增加，目前已达几百万吨，正在逐步取代蔗糖作为食品与饮料的甜味已达几百万吨，正在逐步取代蔗糖作为食品与饮料的甜味剂。美国可口可乐公司所用甜昧剂几乎是高果糖浆。最近剂。美国可口可乐公司所用甜昧剂几乎是高果糖浆。最近食用甜味剂又出现了一颗新星食用甜味剂又出现了一颗新星天冬氨素天冬氨素。它是低热量、。它是低热量、安全，又有一定营养价值的新型安全，又有一定营养价值的新型甜昧二肽甜昧二肽，甜度是蔗糖的，甜度是蔗糖的l50-200l50-200倍，可用酶工程法制备。倍，可用酶工程法制备。第8页/共176页一、特异生物催化剂一、特异生物催化剂酶酶w酶的功能特异，威力非凡，生物的生长、发育、繁殖、营酶的功能特异，威力非凡，生物的生长、发育、繁殖、营养、运动以及发酵、呼吸、光合作用、神经刺激、免疫反养、运动以及发酵、呼吸、光合作用、神经刺激、免疫反应无一不受到酶的催化作用。应无一不受到酶的催化作用。w已知酶的种类约有已知酶的种类约有80008000种，它们都是由生物细胞合成的一种，它们都是由生物细胞合成的一类特殊蛋白质，细胞的一切活动都离不开酶的类特殊蛋白质，细胞的一切活动都离不开酶的“推动推动”。w酶催化活力的高效性和专一性是任何其他催化剂所无法比酶催化活力的高效性和专一性是任何其他催化剂所无法比拟的。正因为体内存在为数众多、魔力非凡的酶，体内的拟的。正因为体内存在为数众多、魔力非凡的酶，体内的生化反应才能在十分温和的条件下飞快地进行。生化反应才能在十分温和的条件下飞快地进行。第9页/共176页二、酶制剂及其剂型二、酶制剂及其剂型w酶制剂酶制剂是指从生物体中经分离、提纯而得到的是指从生物体中经分离、提纯而得到的具有一定具有一定纯度和活力纯度和活力的酶制品。酶制剂的大规的酶制品。酶制剂的大规模生产主要是利用发酵工程技术。模生产主要是利用发酵工程技术。w最初的商品酶制剂主要以最初的商品酶制剂主要以动植物动植物为原料提取，如从为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等。提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等。w之后，之后，TakamineTakamine利用利用霉菌霉菌来生产来生产淀粉酶淀粉酶使得酶制剂使得酶制剂工业取得突破，其方法至今仍被采用。工业取得突破，其方法至今仍被采用。第10页/共176页第二次世界大战以后，第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善，酵工业和设备的渐渐完善，利用微生物来获得利用微生物来获得商品化商品化酶制剂酶制剂已形成规模化产业，已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。并开辟了广阔的市场。第11页/共176页Pilot Biostat UD50第12页/共176页w以微生物酶为主体的酶制剂工业形成于以微生物酶为主体的酶制剂工业形成于5050年代。年代。其中工业用酶其中工业用酶50-6050-60种，治疗和诊断用酶种，治疗和诊断用酶120120多多种，酶试剂种，酶试剂300300多种，已涉及到食品、医药、发多种，已涉及到食品、医药、发酵、日用化工、轻纺、制革、水产、木材、造酵、日用化工、轻纺、制革、水产、木材、造纸、能源、农业、纸、能源、农业、环保环保等经济部门。等经济部门。w因此，人们把酶制剂工业称为工业领域中的因此，人们把酶制剂工业称为工业领域中的“医学金矿医学金矿”。第13页/共176页新型酶制剂新型酶制剂w1、酿造用酶酿造用酶（酒精酿造用酶、啤酒酿造用酶、（酒精酿造用酶、啤酒酿造用酶、白酒酿造用酶、葡萄酒酿造用酶）：纤维素酶、白酒酿造用酶、葡萄酒酿造用酶）：纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶等。半纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶等。w2、食品加工用酶食品加工用酶：谷氨酰胺转胺酶、高果糖浆：谷氨酰胺转胺酶、高果糖浆生产用酶（葡萄糖异构酶、菊粉酶）、果汁专生产用酶（葡萄糖异构酶、菊粉酶）、果汁专用酶（果胶酶、淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白用酶（果胶酶、淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白酶）。酶）。w3、制革用酶制革用酶：蛋白酶。：蛋白酶。第14页/共176页w3、纸浆（造纸）用酶纸浆（造纸）用酶：纸浆漂白用酶（：纸浆漂白用酶（木聚糖木聚糖酶酶）、废纸脱墨用酶（木聚糖酶、甘露聚糖酶、）、废纸脱墨用酶（木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶）、造纸废水处理用酶（脂肪淀粉酶、脂肪酶）、造纸废水处理用酶（脂肪酶、甘露聚糖酶、酶、甘露聚糖酶、漆酶漆酶、果胶酶）。、果胶酶）。w4、洗涤用酶洗涤用酶：碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、淀粉：碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶。酶、纤维素酶。w5、纺织用酶纺织用酶（绿色染整工艺）：果胶酶、纤维（绿色染整工艺）：果胶酶、纤维素酶、素酶、过氧化氢酶过氧化氢酶。w6、饲料用酶饲料用酶：植酸酶、：植酸酶、角蛋白酶角蛋白酶、木聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。第15页/共176页 1 1、干燥粗酶制剂：、干燥粗酶制剂：用麸曲或深层发酵的酶用麸曲或深层发酵的酶培养液除掉菌体（不除掉菌体）后，与淀粉等培养液除掉菌体（不除掉菌体）后，与淀粉等惰性填料混合、干燥制成的粗酶产品。惰性填料混合、干燥制成的粗酶产品。2 2、稀液体酶制剂：、稀液体酶制剂：将酶培养液过滤除去菌将酶培养液过滤除去菌体等杂质后，直接加稳定剂（甘油、乙醇、氯体等杂质后，直接加稳定剂（甘油、乙醇、氯化钠等的复合物）和防腐剂制成的产品。国内化钠等的复合物）和防腐剂制成的产品。国内许多白酒厂用这种液态糖化酶制剂糖化淀粉。许多白酒厂用这种液态糖化酶制剂糖化淀粉。酶制剂剂型酶制剂剂型第16页/共176页3 3、浓浓液液体体酶酶制制剂剂：将将酶酶培培养养液液过过滤滤除除去去菌菌体体等等杂杂质后，质后，浓缩浓缩后再加稳定剂和防腐剂制成的产品。后再加稳定剂和防腐剂制成的产品。4 4、干干燥燥粉粉状状酶酶制制剂剂：我我国国生生产产的的酶酶制制剂剂多多属属此此类类型。其制备工艺为：型。其制备工艺为：工工艺艺1 1：酶酶培培养养液液除除去去菌菌体体浓浓缩缩喷喷雾雾干干燥燥 研磨研磨加稳定剂、惰性填料加稳定剂、惰性填料制成产品；制成产品；工工艺艺2 2：酶酶培培养养液液除除去去菌菌体体硫硫酸酸铵铵盐盐析析或或乙乙醇醇沉沉淀淀干干燥燥研研磨磨加加稳稳定定剂剂、惰惰性性填填料料制制成成产品产品第17页/共176页5 5、结晶酶：、结晶酶：是经过高度纯化而结晶的固体酶制剂。是经过高度纯化而结晶的固体酶制剂。制备过程制备过程：在酶溶液中缓慢加入硫酸铵或氯化：在酶溶液中缓慢加入硫酸铵或氯化钠而使溶液呈轻微浑浊，即接近过饱和状态时，钠而使溶液呈轻微浑浊，即接近过饱和状态时，静置于低温（静置于低温（0-40-4）下就能析出结晶酶。）下就能析出结晶酶。不同种类酶的结晶时间不同，几个小时不同种类酶的结晶时间不同，几个小时-几周。几周。酶结晶条件酶结晶条件：酶蛋白浓度在：酶蛋白浓度在3-50mg/mL3-50mg/mL，酶的，酶的纯度纯度50%50%。6 6、固定化酶：、固定化酶：将酶和酶菌体固定在将酶和酶菌体固定在载体载体上，制成上，制成不溶于水的固态酶，可长时间使用。不溶于水的固态酶，可长时间使用。第18页/共176页n洗涤剂用酶迅速普及西欧、美、日等国；洗涤剂用酶迅速普及西欧、美、日等国；n凝乳酶广泛用于乳酪制造；凝乳酶广泛用于乳酪制造；n酶制剂新市场酶制剂新市场催化剂、医药用酶和催化剂、医药用酶和三废处理用酶三废处理用酶迅速发展；迅速发展；n应用固定化异构酶大量生产高果糖浆；应用固定化异构酶大量生产高果糖浆；n筛选耐高温脂肪酶、糖化酶和蛋白酶；筛选耐高温脂肪酶、糖化酶和蛋白酶；n应用基因工程技术改造和生产新型酶制剂。应用基因工程技术改造和生产新型酶制剂。酶制剂的主要发展动态是：酶制剂的主要发展动态是：第19页/共176页w20世纪世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基酶基因重组因重组，可以在微生物上表达。，可以在微生物上表达。w由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此因此“基因工程发酵工艺先进的发酵设备基因工程发酵工艺先进的发酵设备”可以算是可以算是酶工业的第三次飞跃酶工业的第三次飞跃。第20页/共176页w国际上酶制剂的年产量已超过国际上酶制剂的年产量已超过1010万吨，其万吨，其来源有动物、植物与微生物。来源有动物、植物与微生物。微生物酶制微生物酶制剂是工业酶制剂的主体，年产值已超过剂是工业酶制剂的主体，年产值已超过6 6亿美元。亿美元。由于酶制剂主要作为催化剂与添由于酶制剂主要作为催化剂与添加剂使用，它带动了许多产业的发展。加剂使用，它带动了许多产业的发展。第21页/共176页微生物酶的开发微生物酶的开发1、应用微生物来开发酶的、应用微生物来开发酶的优点优点：(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。微生物生长繁殖快，生活周期短。(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。底物。(3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。物质基础。第22页/共176页微生物酶的开发微生物酶的开发(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。当细胞。第23页/共176页微生物酶开发的一般程序（酶的发微生物酶开发的一般程序（酶的发酵生产）酵生产）(一一)样品的采集样品的采集采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。(二二)菌种的分离菌种的分离培养基的确定、培养条件的确定。培养基的确定、培养条件的确定。(三三)菌种的初筛菌种的初筛1、用简单的定性反应进行初筛；、用简单的定性反应进行初筛；2、在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条、在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。第24页/共176页微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序(四四)菌种的复筛菌种的复筛初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。产要求的菌种。酶活的测定方法的建立尤其重要。酶活的测定方法的建立尤其重要。第25页/共176页微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序(五五)对复筛获得菌株的要求对复筛获得菌株的要求1、不是致病菌；、不是致病菌；2、菌株不易变易和退化；、菌株不易变易和退化；3、不易感染噬菌体；、不易感染噬菌体；4、微生物产酶量高；、微生物产酶量高；5、酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；、酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；6、产生的酶便于分离和提取，得率高；、产生的酶便于分离和提取，得率高；7、微生物培养营养要求低。、微生物培养营养要求低。第26页/共176页微生物酶开发的一般程序微生物酶开发的一般程序(六六)最佳产酶条件的初步确定最佳产酶条件的初步确定1、培养方式的确定；、培养方式的确定；2、最佳培养条件组合；、最佳培养条件组合；3、微生物产酶的特性、微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶胞内酶、胞外酶)；4、微生物酶收集的时间顺序；、微生物酶收集的时间顺序；第27页/共176页(七七)微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高1、获得高产菌种的突变体；、获得高产菌种的突变体；2、利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生、利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；物的酶产量；3、运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌、运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应的微生物细胞之内，使其高效表达；适应的微生物细胞之内，使其高效表达；第28页/共176页三、酶的分离提取三、酶的分离提取酶提取的定义酶提取的定义：是将酶从生物组织或细胞中以是将酶从生物组织或细胞中以溶解状态溶解状态释放出来的过程，以供进一步从中分释放出来的过程，以供进一步从中分离纯化出所需的酶。离纯化出所需的酶。w通常生物材料中所含酶的总量并不太少，但每通常生物材料中所含酶的总量并不太少，但每一种酶的含量却很低，常在一种酶的含量却很低，常在0.0001-10.0001-1，如胰，如胰腺中含有腺中含有5 5的胰蛋白酶，而脱氧核糖核酸酶仅的胰蛋白酶，而脱氧核糖核酸酶仅含含0.0040.004。第29页/共176页w由于各种酶在生物材料中含量很低，因此提取、由于各种酶在生物材料中含量很低，因此提取、分离和纯化各种酶制剂是一项比较复杂的工艺分离和纯化各种酶制剂是一项比较复杂的工艺过程，犹如过程，犹如“沙里淘金沙里淘金”的的“冶炼术冶炼术”。在提取酶之前要进行在提取酶之前要进行预处理预处理，不同的酶有不同，不同的酶有不同的预处理方法。的预处理方法。第30页/共176页1、胞外酶胞外酶的预处理和制备的预处理和制备酶培养液酶培养液：将菌体过滤或离心去除，所得的清液即为：将菌体过滤或离心去除，所得的清液即为粗酶液。粗酶液。酶固态发酵麸曲酶固态发酵麸曲：用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤：用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤去除菌体及杂质后所得清液即为粗酶液。去除菌体及杂质后所得清液即为粗酶液。粗酶液再经粗酶液再经提纯提纯即得精酶制品。即得精酶制品。2、胞内酶胞内酶的预处理：的预处理：胞内酶需要破碎细胞壁、质膜，然后制成无细胞提取胞内酶需要破碎细胞壁、质膜，然后制成无细胞提取液，再提纯。液，再提纯。细胞破碎的方法细胞破碎的方法：干燥法（空气干燥、真空冷冻干燥、：干燥法（空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥）、机械法（研磨法、机械捣碎）、超声波溶剂脱水干燥）、机械法（研磨法、机械捣碎）、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。（一）预处理（一）预处理第31页/共176页机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：TritonTriton、TweenTween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理第32页/共176页第33页/共176页（二）酶的提取（二）酶的提取1 1、水溶液提取法水溶液提取法w用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。（对酶蛋白稳定性好、用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。（对酶蛋白稳定性好、溶解度大）溶解度大）w均匀搅拌、控制好温度（均匀搅拌、控制好温度（55以下）以下）w加入蛋白质水解酶抑制剂：二异丙基氟磷酸、碘乙酸加入蛋白质水解酶抑制剂：二异丙基氟磷酸、碘乙酸w特别注意提取液特别注意提取液pHpH和盐浓度和盐浓度：碱性酶用偏酸性提取液，：碱性酶用偏酸性提取液，酸性酶用偏碱性的提取液。酸性酶用偏碱性的提取液。w大多数蛋白类酶都溶于水，而且在大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐低浓度的盐存在的条存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶盐溶现象。在提取液中加入少量氯化钠（现象。在提取液中加入少量氯化钠（0.15mol/L0.15mol/L）或其）或其他中性盐。缓冲液常用他中性盐。缓冲液常用0.02-0.05mol/L0.02-0.05mol/L酸盐和碳酸盐等酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。渗盐溶液。第34页/共176页2 2、表面活性剂提取法、表面活性剂提取法表面活性剂表面活性剂：w天然的胆酸盐、磷脂；天然的胆酸盐、磷脂；w人工合成的离子型人工合成的离子型十二烷基硫（磺）酸十二烷基硫（磺）酸钠（钠（SDS、阴离子型）、二乙氨基十六烷、阴离子型）、二乙氨基十六烷基溴（阳离子型），非离子型基溴（阳离子型），非离子型吐温、三吐温、三通通-X-X（Triton-X）。）。第35页/共176页3 3、有机溶剂（丁醇）提取法、有机溶剂（丁醇）提取法w对不溶于水、稀盐溶液、稀碱稀酸，以及对不溶于水、稀盐溶液、稀碱稀酸，以及和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的酶（的酶（脂蛋白脂蛋白），可用乙醇、丙酮、），可用乙醇、丙酮、丁醇丁醇等有机溶剂（亲水性、亲脂性强）提取。等有机溶剂（亲水性、亲脂性强）提取。w蛋白酶（胞外酶工业提取流程图，书蛋白酶（胞外酶工业提取流程图，书363363页）页）第36页/共176页提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的盐溶的盐溶液液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶较大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH2pH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取pH8pH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶稳定性较好的酶有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶有较多非极性基团的酶第37页/共176页四、酶的纯化四、酶的纯化w提取的酶要先浓缩、去杂质后再纯化。提取的酶要先浓缩、去杂质后再纯化。w（一）（一）浓缩浓缩w浓缩方法：葡聚糖凝胶浓缩方法：葡聚糖凝胶-分子筛浓缩法、聚乙二分子筛浓缩法、聚乙二醇（醇（PEG）浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、）浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离法。盐析或乙醇沉淀后分离法。w（二）（二）去杂质去杂质w去杂质的方法：去杂质的方法：pH沉淀法、利用蛋白质热变性沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异法、蛋白沉淀剂法。的温度差异法、蛋白沉淀剂法。第38页/共176页w1 1、盐析法盐析法。采用中性的。采用中性的硫酸铵硫酸铵、硫酸镁、氯化、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠来纯化酶。钠、磷酸氢二钠来纯化酶。w2 2、有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法。在酶溶液中缓慢加入相当。在酶溶液中缓慢加入相当于酶溶液浓度于酶溶液浓度2 2倍的有机溶剂（乙醇或丙酮），倍的有机溶剂（乙醇或丙酮），以降低酶溶液的电解常数，增加酶蛋白分子电以降低酶溶液的电解常数，增加酶蛋白分子电荷间的引力，导致酶蛋白的溶解度下降而沉淀。荷间的引力，导致酶蛋白的溶解度下降而沉淀。w3 3、层析法层析法。包括吸附层析法、离子交换层析法、。包括吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析（凝胶过滤层析）法、等电点分子筛过滤层析（凝胶过滤层析）法、等电点沉淀法。沉淀法。（三）纯化（三）纯化第39页/共176页酶的纯化酶的纯化溶溶解解度度的的差差异异盐析法盐析法PEG沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法等电点沉淀法热稳定性的差异热稳定性的差异热处理沉淀法热处理沉淀法第40页/共176页电荷性质的差异电荷性质的差异离子交换层析法离子交换层析法电泳法电泳法分子大小分子大小和形状的和形状的差异差异凝胶过滤法凝胶过滤法超滤法超滤法透析法透析法离心法离心法亲和力的差异亲和力的差异亲和层析法亲和层析法疏水作用的差异疏水作用的差异疏水层析法疏水层析法分配系数的差异分配系数的差异双水相系统萃取法双水相系统萃取法第41页/共176页（四）结晶（四）结晶w当酶达到一定纯度后，在适当的温度、当酶达到一定纯度后，在适当的温度、pH条件下，逐渐加入条件下，逐渐加入硫酸铵溶液硫酸铵溶液（或某（或某些有机溶剂），酶可慢慢析出结晶。些有机溶剂），酶可慢慢析出结晶。第42页/共176页酶分离提纯步骤如下：酶分离提纯步骤如下：半匀浆半匀浆选材提取液粗酶制品精制细胞器纯酶酶结晶抽取或抽取或分散分散亲和亲和分离法分离法少量酶少量酶分离方法分离方法结晶法结晶法第43页/共176页 酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。第44页/共176页在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法常用的干燥方法有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥。干燥、吸附干燥。五、酶的干燥五、酶的干燥第45页/共176页六、固定化酶与固定化细胞六、固定化酶与固定化细胞w固定化酶与固定化细胞是酶工程的固定化酶与固定化细胞是酶工程的核心核心“软软件件”，因为以它为基础就可以根据化学反应因为以它为基础就可以根据化学反应工程的需要，组装成工程的需要，组装成高效、连续运转的生物高效、连续运转的生物反应器反应器，再与其他工程设备、电子元件配套，再与其他工程设备、电子元件配套形成完整的形成完整的生物反应工艺装置生物反应工艺装置。1 1、固固定定化化酶酶：又又称称水水不不溶溶酶酶，是是从从筛筛选选、培培育育获获得得的的优优良良菌菌种种中中提提取取活活性性高高的的酶酶，再再用用包包埋埋法法（或或交交联联法法、载载体体结结合合法法、逆逆胶胶束束酶酶反反应应系系统统等等）将将酶酶固固定定在在载载体体上上，制制成成不不溶溶于水的固态酶，即固定化酶。于水的固态酶，即固定化酶。（一）固定化酶和固定化微生物（一）固定化酶和固定化微生物第46页/共176页水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术什么是固定化酶？什么是固定化酶？第47页/共176页化学偶联化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联交联包埋包埋吸附吸附间歇间歇连续连续酶的固定化技术和固定化酶酶的固定化技术和固定化酶第48页/共176页通过物理吸附法或化学键合法将水溶性酶和固态通过物理吸附法或化学键合法将水溶性酶和固态的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水但仍保的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物。留催化活性的衍生物。第49页/共176页w(1)(1)酶的稳定性差酶的稳定性差,在温度、在温度、pHpH和无机离子等外界因和无机离子等外界因素的影响下素的影响下,容易变性失活容易变性失活w(2)(2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产不便连续化生产w(3)(3)酶反应后成为杂质与产物混在一起酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯增加分离纯化的困难化的困难直接应用酶的不足之处直接应用酶的不足之处:第50页/共176页改善方法之一改善方法之一w思路：思路：设计一种方法设计一种方法,将酶束缚于特殊的相将酶束缚于特殊的相,使使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分子它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分子交换。这种交换。这种固定化的酶固定化的酶可象一般化学反应中的可象一般化学反应中的固体催化剂一样既有酶催化特性固体催化剂一样既有酶催化特性,又有一般化又有一般化学催化剂能回收，反复使用等优点学催化剂能回收，反复使用等优点,并可使生并可使生产工艺连续化自动化。产工艺连续化自动化。(1)(1)固定化酶固定化酶(2)(2)固定化菌体固定化菌体(死细胞死细胞)(3)(3)固定化活细胞固定化活细胞(增殖细胞增殖细胞)(4)(4)固定化原生质体固定化原生质体(5)(5)固定化动植物细胞固定化动植物细胞第51页/共176页发展历史发展历史19531953年年,德国德国,Grubhofer,Grubhofer、Schleith,Schleith,聚氨基苯乙聚氨基苯乙烯树脂为载体，重氮法烯树脂为载体，重氮法;19691969年，日本，千年，日本，千畑畑一郎，固定化氨基酰化酶，一郎，固定化氨基酰化酶，从从DL-氨基酸连续生产氨基酸连续生产L-L-氨基酸，氨基酸，首次工业规模首次工业规模应用固定化酶应用固定化酶，促使，促使酶工程酶工程作为一个独立的学科作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来从发酵工程中脱离出来;19711971年，第一次国际酶工程会议确定固定化酶统年，第一次国际酶工程会议确定固定化酶统一英文名称为一英文名称为Immobilized EnzymeImmobilized Enzyme。第52页/共176页19731973年，日本首次在工业上成功应用固定化大肠年，日本首次在工业上成功应用固定化大肠杆菌菌体中杆菌菌体中天门冬氨酸酶天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续，由反丁烯二酸连续生产生产L-L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。19761976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精；酒精；19781978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀粉酶，年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀粉酶，开始了开始了固定化细胞产酶的先例固定化细胞产酶的先例。19791979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功；年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功；19821982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸。氨酸。第53页/共176页优点优点w(1)(1)提高酶稳定性；提高酶稳定性；w(2)(2)可反复或连续使用；可反复或连续使用；w(3)(3)易于和反应产物分开；易于和反应产物分开；w（4 4）酶反应过程可严格控制；）酶反应过程可严格控制；w（5 5）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；w（6 6）较游离酶更适合多酶反应；）较游离酶更适合多酶反应；w（7 7）增加产物收率，提高产物质量；）增加产物收率，提高产物质量；w（8 8）酶的使用效率提高，成本降低。）酶的使用效率提高，成本降低。缺点缺点（1 1）固定化时酶活有损失；）固定化时酶活有损失；（2 2）增加了生产初始成本；）增加了生产初始成本；（3 3）只能用于可溶底物且较小分子；）只能用于可溶底物且较小分子；（4 4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5 5）胞内酶须分离。）胞内酶须分离。第54页/共176页固定化酶制备原则固定化酶制备原则（1 1）维持酶的催化活性及专一性；）维持酶的催化活性及专一性；（2 2）有利于生产自动化、连续化；）有利于生产自动化、连续化；（3 3）应有最小的空间位阻；）应有最小的空间位阻；（4 4）酶与载体必须结合牢固；）酶与载体必须结合牢固；（5 5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或 反应液发生化学反应；反应液发生化学反应；（6 6）成本要低。）成本要低。第55页/共176页（二）固定化酶和固定化微生物（二）固定化酶和固定化微生物的固定化方法（的固定化方法（固定化技术固定化技术）1.微型胶囊法微型胶囊法2.吸附吸附3.通过双功能试剂进行共价交联通过双功能试剂进行共价交联4.胶格包埋胶格包埋5.和水不溶性载体共价结合和水不溶性载体共价结合第56页/共176页固定化方法固定化方法吸附法吸附法共价键结共价键结合法合法包埋法包埋法交联法交联法第57页/共176页酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法载体结合法载体结合法载体结合法载体结合法交联法交联法交联法交联法包埋法包埋法包埋法包埋法 网格型网格型网格型网格型微囊型微囊型微囊型微囊型物理吸附法物理吸附法物理吸附法物理吸附法 离子结合法离子结合法离子结合法离子结合法共价结合法共价结合法共价结合法共价结合法热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）热处理（细胞）第58页/共176页第59页/共176页酶固定化的模式图酶固定化的模式图A-A-载体结合法；载体结合法；B-B-交联法；交联法；C1-C1-包埋法（格子型）包埋法（格子型）C2-C2-包埋法（微胶囊型）；包埋法（微胶囊型）；D-D-逆胶束酶反应系统逆胶束酶反应系统第60页/共176页酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式酶和细胞固定化模式第61页/共176页1 1、载体结合法、载体结合法以以共共价价结结合合、离离子子结结合合和和物物理理吸吸附附等等方方法法将将酶酶固固定定在非水溶性载体上的方法。在非水溶性载体上的方法。包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法、生包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法、生物特异结合法四种。物特异结合法四种。常用载体常用载体：葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多：葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝等。孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝等。第62页/共176页吸附法吸附法用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法使其固定的方法;固体吸附剂固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等璃等;(1)(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用载体廉价易得，可反复使用;(2)(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落脱落.back第63页/共176页高岭土（Kaolinite）硅藻土(Diatomite)第64页/共176页物理吸附法物理吸附法-利用各种固体吸附剂将酶利用各种固体吸