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猪细小病毒最新研究成果综述,病毒学论文内容摘要：猪细小病毒Porcine parvovirus, PPV是猪繁衍障碍最常见和最重要的病原之一。一直以来，人们以为PPV的遗传变异性很低，通过接种疫苗能够很好地控制该病毒的传播。然而，该病毒的多样性比预期的要大得多，并且一些新出现的强毒株不能被经典PPV疫苗株的抗血清有效中和，导致免疫失败。通过总结PPV研究的最新成果，全面更新对PPV生物学的理解，揭示在选择压力下，PPV新毒株出现的潜在风险及其对养猪业的危害，旨在为制定PPV的有效防控策略提供参考。 本文关键词语：猪细小病毒； 生物学特性； 发病机制； 遗传变异； 作者简介： 陈玉梅 1982- ,女，河南南阳人，讲师，博士，主要从事动物疫病免疫机制与疫苗研究。E-mail: yumeichen2020; 周景明 1972- ,男，河南新野人，教授，博士，主要从事畜禽疫病快速诊断技术、动物疫病免疫机制与疫苗研究。E- mail: zhjingming; The Novel Progress of the Biology of Porcine Parvovirus Abstract:Porcine parvovirus PPV is the most common and important infectious agents causing porcine reproductive failure. All the time, it was thought that PPV had low genetic variance, and its harmful effect on pig industry could be well-controlled by vaccination. However, subsequent studies found that the persity of PPV was much greater than previously anticipated.Some of the new highly virulent, which cannot be neutralized effectively by antisera raised agains told classical PPV vaccine strains, were isolated. The purpose of this review is to summarize the recent results of PPV research, update the present understanding of PPV biology,and reveal the potential risks of new PPV strains and their harm to pig industry under the pressure of selection, which will provide reference for formulating effective prevention and control strategies of PPV. Keyword:Porcine parvovirus; Biological characteristics; Pathogenesis; Genetic variation; 猪细小病毒Porcine parvovirus, PPV属细小病毒科Parvoviridae、原细小病毒属Protoparvovirus中的有蹄类原细小病毒1Ungulate parvovirus 1,UPV11.PPV最早于20世纪60年代末被确以为细小病毒科成员，是SMEDI综合征Stillbirths, mummification, embryonic death, and infertility,SMEDI即猪死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕的病原体2,对养猪业危害极大。一直以来，人们以为PPV的遗传变异性很低，通过接种疫苗能够很好地控制该病毒的传播。然而，随着不能被经典PPV疫苗的抗血清有效中和的强毒株的出现，人们逐步意识到该病毒的多样性比先前预期的要大得多。因而，追踪PPV研究的最新成果，全面更新对PPV生物学的理解，对于制定PPV的有效防控策略具有重要参考意义。 1、PPV的分子生物学特性 PPV是一种小的、无包膜的单链DNA病毒，基因组长约46.3 kb3.病毒的2个末端序列构成大约120200个碱基的复杂回文发夹构造呈类似的 Y 或 T 形4.PPV的紧凑型基因组只包含2个启动子，共编码7种蛋白质，并利用选择性剪接技术来扩展基因组的编码能力。2种非构造蛋白NS1和NS2是从p4启动子转录而来，这些蛋白质对病毒复制十分是DNA复制很重要4;另外，还可能含有一种假定的非构造蛋白NS3.PPV的2种构造蛋白VP1和VP2从p40启动子转录。二者是从一组嵌套的编码序列中翻译出来的，它们的氨基末端不同，较小的VP2是从与较大的VP1一样的RNA模板中剪接产生的。VP1有729个氨基酸残基aa，华而不实氨基末端前120个氨基酸是VP1特有的VP1 unique region,VP1u。而PPV的第三种构造蛋白VP3是VP2的翻译后修饰产物。除此之外，晚期非构造蛋白SAT是由与VP2一样的mRNA启动VP2起始密码子下游的7个核苷酸表示出而来的。PPV的外壳是由60个VP1或VP2构造蛋白分子组成的球形构造，呈二十面体对称排列。每个衣壳亚单位由8条反平行 链及1个 螺旋和4个环Loop组成图1 4,5.VP1蛋白大约占病毒粒子的10%,主要在病毒复制和感染细胞时发挥作用，VP2蛋白是PPV的主要构造蛋白，占病毒粒子的60%以上，也是病毒的主要免疫原性蛋白。VP1/VP2基因对于PPV的系统发育分析至关重要6. 图1 PPV VP2蛋白3D模型A及病毒衣壳构造B 2、PPV发病机制 PPV毒株毒力是由其可能引起的繁衍失败的严重程度来定义的7.大多数情况下，未怀孕成年猪或仔猪单纯感染PPV不会出现临床异常感觉和状态，而胎儿感染的结果随母猪妊娠的进展而变化，流行病学研究表示清楚，母猪妊娠前半期PPV感染可导致生殖衰竭，PPV经口服途径初次感染母猪后2332 d穿过胎盘，经肌肉注射途径感染时间稍短，约15 d 8.研究发现，仅在胎儿产生抗体前发生的感染才会导致死亡和木乃伊化，妊娠70 d后，胎儿产生抗体反响，通常在这一时期以后的感染胎儿能够存活图22.除感染时间外，病毒的遗传组成对胎儿感染的结果有决定性影响，低致病性毒株和疫苗株如NADL-2和MSV不能像高致病性毒株如Kresse毒株和27A毒株一样有效地穿过胎盘屏障7,因而，它们对妊娠的影响不易检测到。然而，直接向羊水中注射NADL-2毒株可导致胎儿死亡9.而关于PPV怎样通过胎盘屏障诱导生殖失败还不清楚，没有证据表示清楚PPV可在子宫上皮或原肌中复制，因而，通过屏障复制理论不成立7.单核细胞和腹腔巨噬细胞可吞噬NADL-2,据此有研究者猜想PPV可通过母体巨噬细胞侵入胎儿10.事实上，当前并没有任何直接证据表示清楚巨噬细胞能够将PPV从母亲直接传递到胎儿。 用不同毒株PPV感染妊娠母猪的试验表示清楚，NADL-8毒株要到达可经胎盘妊娠感染所需的毒量是NADL-2毒株的10 000倍以上11.而PPV不同毒株感染的胚胎中病毒DNA的组织分布和数量存在显着差异，在肝脏中通过原位杂交试验检测到Kresse毒株和NADL-8毒株，而在大脑和脾脏仅检测到Kresse毒株12.实时荧光定量PCR检测结果显示，PPV 27a分离株在包括结肠、十二指肠、空肠、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胸腺、性腺等10个不同胎儿器官中的病毒滴度在10111015拷贝/106个细胞，而毒性较小的PPV-143a毒株和疫苗株NADL-2毒株和MSV毒株主要在肾脏中检出，且病毒滴度较低 103拷贝/106个细胞9.相关研究结果表示清楚，PPV毒株的组织特异性及其在胚胎中感染起始能力的差异可能在胎儿感染及致病性方面发挥重要作用9,10,11,12. 图2 PPV感染和免疫应答的主要时间点 3、PPV与细胞的互相作用 在乳猪和老年猪体内靶细胞中检测PPV比拟困难。研究显示，PPV能够在活化的淋巴细胞中复制，但不能在血单核细胞中复制，而在巨噬细胞中的复制能力还存在争议2.PCR检测发现，PPV可在心脏、肺脏、肾脏、脾脏、子宫内膜和小肠的细胞中繁衍，然而，PCR检测却不能区分是器官本身细胞中产生的病毒还是通过血液循环系统运输的病毒9,13.PPV进入细胞的第一步是病毒离子与细胞外表糖蛋白的末端唾液酸位点结合，通过胞吞作用抑制剂阻断试验结果表示清楚，除了网格蛋白介导的内吞作用和大胞饮作用外，还有第3种未知的进入机制可能介入PPV入胞，而小窝蛋白Caveolae介导的内吞途径不起任何作用，单个PPV颗粒倾向于通过网格蛋白介导的内吞作用进入胞内，而PPV聚集物倾向于大胞饮作用14.核内体易位到晚期核内体或溶酶体以及感染后210 h的酸化作用对PPV的有效感染至关重要14.研究表示清楚，泛素化以及细胞质中蛋白酶体的互相作用是PPV有效感染必不可少的步骤，病毒颗粒向细胞核运动时牵涉微管和肌动蛋白网络。微管在感染前810 h至关重要，这表示清楚微管在PPV向核周区的内质转运中起重要作用。在感染后期1216 h肌动蛋白活性对增殖性感染是必需的，它可能对传入病毒的转运以及对新合成蛋白质的核转运都是必需的14. 核定位序列Nuclear localization signals, NLS对蛋白质能被顺利转运进细胞核至关重要。腺相关病毒的衣壳蛋白具有4个潜在的NLS,分别为下面4个基本区域Basic region, BR：BR1、BR2、BR3和BR4.类似于小鼠微小病毒Minute virus of mice,MVM，PPV的VP1u含有5个潜在的NLS,即BR1 3PPAKRAR9、BR2 86RAKR89、BR3 110RRSPRK115、BR4 124KR125和BR5 133KKKAK137 15.华而不实BR1是一个经典的含有7个氨基酸的NLS,而BR4和BR5是典型的二元核定位信号Bipartite NLSs, B-NLSs，这2种NLSs都是病毒复制的必要条件16,它们的突变不影响病毒的装配，但可影响病毒增殖，表示清楚它们在感染早期负责病毒的核转运。另外，在PPV衣壳中还可能存在3个非线性核定位基序Nuclear localization motif, NLM，包装好的PPV衣壳外表的外部区域包含R374、R393和R565、PPV VP2三聚体内部区域的中心区域包含K475、R477及病毒衣壳内外表的内部区域包含K272、K275、K487、R533、K535、R576 15,16.在所有原细小病毒中，VP1 NLS和VP2 NLM在病毒装配经过中被内化到细胞核中，且不可接近转运蛋白。研究证明，MVM是主动从核中运输出来的17.据揣测在原细小病毒粒子上，NLM或NLS的存在会干扰这种传输。然而，对PPV而言，当前并没有任何证据表示清楚组装好的PPV病毒离子能够向细胞膜的任何囊泡转运2. 当前，已经知道的大多数影响PPV生物学特性的突变都是在衣壳蛋白上发现的，唯一例外的是NADL-2毒株NS1蛋白的I481L突变，该突变位点与VP2的N348H突变一起作用有助于NADL-2毒株在犬细胞系A72中产生细胞病变效应并以高滴度复制。NADL-2毒株和Kresse毒株的基因组在右端尾部发夹构造附近有13个核苷酸Nucleotides, nt和127 nt的重复序列。这2种病毒的构造蛋白之间只要6个氨基酸差异，华而不实5个氨基酸差异I215T、D378G、H383Q、S436P和R565K也存在于其他毒力毒株中。定位于衣壳外表的3个氨基酸差异D378G、H383Q和S436P使NADL-2毒株不能在原代牛睾丸细胞TV中的复制，并将滴度和细胞病变效应降低到与猪源细胞系PT和PFT中Kresse毒株相当的水平18,后来发现，S436P在体外不介入组织向性3.由于在毒力毒株27a毒株和无毒力毒株143a毒株的436位氨基酸均为苏氨酸Thr，进一步从侧面证实VP2的D378G和H383Q的氨基酸突变可能改变PPV的致病性7. PPV感染后3 h可促进PK-15细胞中p53的积累，p53通过线粒体介导的凋亡途径激活Caspase-9和Caspase-3,进而使线粒体释放细胞色素C19.在PPV YL株感染60 h后的猪睾丸细胞ST和PK-15细胞中，凋亡细胞的比例可达50%,而在PPV Kresse毒株感染的PT细胞中，凋亡细胞的数量仍低于14%2,20.Kresse毒株感染期间PT细胞死亡的主要形式包括感染核肿胀、早期细胞膜衰竭如碘化丙啶摄取、乳酸脱氢酶快速释放和病毒DNA自由释放，这些形式最终均指向坏死20.即便PPV衣壳的微小突变也能改变其与宿主间的互相作用，并改变病毒的细胞病变效应2,21.PPV感染所引发的病变效应在很大程度上取决于毒株类型和细胞类型。然而，细胞早期解体加速了PPV的体外释放和扩散，这些经过对体内病毒的生命周期有非常显着的影响。在PPV中已经进化出一种能够促进细胞快速溶解和病毒释放的小的选择性翻译蛋白Small alternatively translated protein, SATp，该蛋白与VP2共用1套mRNA,其起始密码子是VP2起始密码子下游的7个核苷酸。SATp是一种内质网ER驻留的短膜蛋白68AA，包含1个跨膜螺旋，可加速细胞死亡和病毒传播2.无论能否存在SATp,在受感染的PT细胞中，PPV感染都会诱导未折叠蛋白反响unfolded protein response, UPR。在感染后1214 h,它还导致抗凋亡的内质网应激蛋白X盒结合蛋白1X-box binding protein 1, XBP1可逆地激活。在感染后期，SATp的存在通过使ER应激不可逆加速细胞凋亡。 4、PPV的遗传变异与进化 一直以来，研究者以为PPV的基因组比其他细小病毒更保守5.然而，近期研究者发现PPV的基因组并不是原以为的那么保守，通过系统研究野外分离株中VP蛋白的遗传多样性，PPV至少分为7个簇Cluster，华而不实C和D簇中欧洲毒株占优势，而F簇中中国毒株占优势，未观察到野猪分离株的分簇与地理分布的类似关系4.在同一地区，野猪种群中检测到的PPV比家猪中的PPV的具有更多的多样性。相关研究表示清楚，传统的PPV疫苗株的抗血清不能有效中和D簇中一些新的强毒株22.据揣测，这些突变体可能是逃避疫苗接种所带来的免疫压力而产生的。然而，根据现有的序列分析发现，在组织培养或接种牛群中存在抗体时，观察到的PPV遗传多样性降低，而在疫苗株衣壳上发现的一些突变位点NADL-2毒株 I320S,H383Q;Str.Challenge毒株S45T,P436S也没有出如今新的PPV突变体上23.因而，能够以为疫苗接种失败和未接种动物如野猪种群对新出现的表型产生的影响可能比接种种群更重要。 PPV分离株的系统发育与毒力之间没有显着的相关性。病毒毒力强弱可能直接或间接影响如组织特异性和长期/高滴度脱落等生物学特征，这也决定了PPV毒株在高度可变的田间条件下的适宜性。对田间毒株的NS和VP基因突变形式的研究表示清楚，这2个编码区的进化有明显差异，VP基因的突变率是华而不实1个NS基因10-5的3050倍约35 10-4突变/核苷酸 年2.这与在NS区域发现的非同义和同义取代率之间的负差异一起表示清楚，允许NS蛋白质维持功能的核苷酸变化数量是有限的，同时纯化选择Purifying selection即负选择Negative selection决定了该区域的进化。相反，早期的研究表示清楚，VP1/VP2基因是在近中性形式漂移下进化的2,但在决定细胞互相作用和免疫原性的衣壳外环上的几个位置被正选择Positive selection24.除此之外，大多数突变发生在外表环，华而不实215、228、383、414、419、436位氨基酸似乎是衣壳中的主要可变位点2,24.普遍以为，小DNA病毒中CpG缺失的主要原因是来自复制优势和/或免疫逃逸的自然选择。PPV基因组是CpG缺失的，CpG位点比PPV基因组中的GC或C和G位点更容易发生突变。因而，突变压力而不是选择力，是导致PPV基因组中CpG表示出缺乏的原因2. 5、PPV的检测与预防 PPV常用的检测方式方法有分子生物学检测方式方法、血清学检测方式方法等，华而不实分子生物学检测方式方法主要包括常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR25、环介导等温扩增技术LAMP、聚合酶重组酶扩增技术RPA26以及基因芯片检测技术等2.由于PPV能凝集鸡、豚鼠、小鼠、人、猴、鼠和猫的红细胞，因而，血凝Hemagglutinationassays,HA和血凝抑制试验Hemagglutination inhibition assays,HAI仍然是一种有效的PPV血清学检测方式方法，在研究和实践中广泛使用。而酶联免疫吸附试验ELISA是最常用的检测PPV特异性抗体的方式方法；血清学方式方法还包括病毒中和试验、改进的直接补体结合Modified direct complement-fixation,MCDF试验等。另外，还有基于NS1蛋白的区分感染动物和接种动物的重组pADifferentiating infected from vaccinated animals试验等2.PPV病毒的感染一旦开场则很难去除，所以控制PPV流行的主要措施是接种疫苗。当前，使用较广泛的疫苗是PPV灭活苗和弱毒苗，另外PPV病毒样颗粒VLPs疫苗的研究也很多，PPV疫苗的应用在很大程度上控制了PPV的流行和传播27.但由于PPV新的强毒株的出现及经典疫苗防治失败的案例的出现对PPV疫苗提出来新的挑战。 6、小结 随着生物学技术的飞速发展，PPV的分子生物学相关研究已获得了很大进展，在PPV的检测与预防方面也获得了进展，PPV疫苗的使用在很大程度上控制了PPV的流行和传播。但是，仍然会有因免疫失败引发的PPV疫情报道。一直以来，人们以为该病毒的遗传变异性很低，然而，随后的研究揭示了该病毒的多样性比先前预期的要大得多，PPV的核苷酸替换率大约为每年每个位点对NS1基因进行10-5次替换，每年每个位点对VP1和VP2基因进行10-4次替换，这些比率与RNA病毒中的核苷酸替代率类似2,3,28.因而，随着时间的推移，常有新的PPV毒株出现，对养猪业造成潜在的威胁。在过去的几年里，也有很多新的PPV毒株被报道，但是关于这些病毒在发生和流行的信息及其更深切进入的研究却很缺乏。适时追踪PPV研究前沿，密切监测新毒株的出现，并对这些新毒株与经典流行毒株的致病性等特征进行深切进入研究，对于新型广谱疫苗的研制及有效防控PPV新毒株的感染流行具有重要意义。 以下为参考文献 1 GAVA D, SOUZA CK, MORES TJ, et al.Dynamics of vanishing of maternally derived antibodies of Ungulate protoparvovirus 1 suggests an optimal age for gilts vaccinationJ. 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