骨髓间充质干细胞增殖分化中氯化锂的功能探究,细胞生物学论文.docx

骨髓间充质干细胞增殖分化中氯化锂的功能探究,细胞生物学论文摘 要： 背景:寻找促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化的方式方法, 能够为治疗骨质疏松类疾病提供治疗思路。目的:讨论氯化锂调控大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的机制。方式方法:实验采用全骨髓细胞接种法和贴壁纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞, 分别给予0, 2, 5 nmol/L氯化锂进行干涉;采用CCK-8法检测大鼠骨髓间充质干细胞的增殖情况, 茜素红染色法检测钙化结节构成情况, PNPP法测定碱性磷酸酶活性, Western blot法检测大鼠骨髓间充质干细胞中GSK3 , p-GSK3 , -catenin蛋白含量变化。结果与结论:2, 5 nmol/L氯化锂均能促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖, 5 nmol/L氯化锂促增殖能力最强;2, 5 nmol/L氯化锂组矿化结节与碱性磷酸酶活性均比0 nmol/L氯化锂组明显, 且5 nmol/L氯化锂促成骨分化更为显着;2, 5 nmol/L氯化锂能够显着增加p-GSK3 、 -catenin蛋白表示出, 而各组GSK3 蛋白表示出差异无显着性意义;结果表示清楚, 氯化锂能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及向成骨细胞分化, 其可能机制是通过调控Wnt/ -catenin信号通路相关蛋白表示出实现的。 本文关键词语： 氯化锂; 骨髓间充质干细胞; 细胞增殖; 成骨分化; 钙化结节; 碱性磷酸酶活性; Wnt/ -catenin信号通路; 国家自然科学基金; Abstract： BACKGROUND: Seeking proper methods to promote the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells can provide therapeutic ideas for the treatment of osteoporosis.OBJECTIVE: To study the mechanism of lithium chloride on the proliferation and differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured with the whole bone marrow cell inoculation and adherent purification, followed by intervention with 0, 2, 5 nmol/L lithium chloride. Cell counting kit-8 was used to detect the effect of lithium chloride on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. Alizarin red staining was used to determine calcified nodules.PNPP method was applied to measure alkaline phosphatase activity. The contents of glycogen synthase kinase 3 , phosphorylated glycogen synthase kinase 3 and -catenin in rat bone marrow mesenchymal stem cells were determined by western blot.RESULTS AND CONCLUSION: Lithium chloride, 2 and 5 nmol/L, promoted the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and5 nmol/L lithium chloride had the strongest proliferative effect. Compared with 0 nmol/L group, more calcified nodules and higher alkaline phosphatase activity were observed in the 2 and 5 nmol/L groups, especially in the 5 nmol/L group. Both 2 and 5 nmol/L lithium chloride upregulated the expression of phosphorylated glycogen synthase kinase 3 and -catenin proteins, but showed no difference in the expression of glycogen synthase kinase 3 . In conclusion, lithium chloride can promote the proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells, and the possible mechanism is through the regulation of Wnt/ -catenin signaling pathway-related protein expression. Keyword： lithium chloride; bone marrow mesenchymal stem cells; cell proliferation; osteogenic differentiation; calcified nodules; alkaline phosphatase activity; Wnt/ -catenin signaling pathway; National Natural Science Foundation of China; 0、引言Introduction 骨髓间充质干细胞具有自我更新、增殖潜能和分化成多种细胞类型的能力, 包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经元等1,2,3。骨髓间充质干细胞向脂肪细胞和成骨细胞的分化是竞争性调节的4,5, 在骨微环境平衡中起着关键的作用。在正常条件下, 骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化之间的平衡趋向成骨分化, 维持正常骨构成6,7,8;但是在非正常情况下, 如骨质疏松患者骨髓间充质干细胞分化的平衡可能被毁坏, 骨髓间充质干细胞具有较低的生长速度, 并表现出以减少成骨为代价的脂肪细胞分化, 导致低骨量和高骨髓脂肪量9,10,11。因而, 骨髓间充质干细胞的增殖和分化已经成为骨质疏松的治疗靶点。 骨髓间充质干细胞的增殖和分化遭到多种信号通路和相关蛋白的调控, 华而不实经典Wnt/ -catenin信号通路通过调节下游相关蛋白表示出对成骨细胞分化和成骨脂肪源性反向分化进行调节12,13。研究发现氯化锂能够通过调节Wnt信号通路中 -catenin、GSK3 和cyclinD1蛋白表示出诱导毛囊干细胞的定向分化14, GSK3 作为Wnt/ -catenin通路中关键的调控蛋白介入细胞内糖代谢经过, 对于干细胞的增殖、分化和凋亡具有重要的调控作用15,16,17。前期研究发现氯化锂能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化, 然而其作用机制并不明确。因而, 该研究采用不同浓度的氯化锂对大鼠骨髓间充质干细胞进行处理, 讨论氯化锂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用机制。 1、 材料和方式方法Materials and methods 1.1、 设计 随机分组, 比照观察体外细胞实验。 1.2、 时间及地点 实验于2021年1月至2021年5月在黑龙江中医药大学方剂实验室完成。 1.3、 材料 1.3.1、 实验动物 4周龄SPF级健康雌性SD大鼠10只, 体质量180-200 g, 由黑龙江中医药大学提供, 动物合格证编号SCXK黑2021004。 1.3.2、 实验药物与试剂 氯化锂 (Sigma, 美国) ;胎牛血清、 -MEM培养基、青霉素-链霉素混合液和胰酶 (Hyclone, 美国) ;CCK-8 (同仁, 日本) ;GSK3 、p-GSK3 、 -catenin、GAPDH抗体 (Abcm公司) ;维生素C、 -甘油磷酸钠、地塞米松 (Sigma, 美国) ;茜素红染液 (索莱宝, 中国) ;对硝基苯磷酸二钠 (PNPP) (大连美伦, 中国) 。 1.4 、实验方式方法 1.4.1、 骨髓间充质干细胞的分离和培养18 SD大鼠采用颈椎脱臼法处死浸泡于体积分数为75%乙醇中10 min, 无菌条件下取双侧股骨、胫骨以及肱骨, 置于无血清培养液中, 剪断双侧干骺端, 暴露出骨髓腔, 用1 mL注射器汲取培养基反复冲洗骨髓腔, 收集细胞冲洗液于离心管中, 800 r/min离心10 min, 弃上清, 用含有体积分数为10%胎牛血清的完全培养液重悬细胞, 于体积分数为5%CO2、37培养箱内培养, 12 h后换液, 去除未贴壁细胞, 以后每3 d换液1次, 当细胞长满后传代, 应用倒置显微镜对细胞形态进行观察。 1.4.2、 CCK-8法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力 将第3代骨髓间充质干细胞浓度调整为1 107 L-1, 接种于96孔培养板, 每孔200 L, 置于体积分数为5%CO2的37培养箱中进行培养, 待细胞长满瓶底80%以上时, 每孔分别参加0, 2, 5 nmol/L氯化锂继续培养24 h, 每孔参加10 L CCK-8继续培养4 h, 用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度值。 1.4.3、 采用茜素红染色法检测成骨细胞钙化结节构成情况19 将细胞传代3次后, 在矿化诱导培养基 (100 nmol/L抗坏血酸, 10 mmol/L -甘油磷酸, 7 mol/L地塞米松) 中对细胞进行成骨性诱导培养。待细胞贴合至80%后, 按终浓度分别为0, 2, 5 nmol/L参加氯化锂培养21 d, 弃培养液, PBS冲洗细胞3次, 体积分数为95%乙醇固定15 min, 参加0.1%茜素红染色, 37孵育1 h, 双蒸水冲洗3次, 观察并照相。 1.4.4、 采用PNPP法测定成骨细胞的碱性磷酸酶活性20 细胞培养和处理方式同1.4.3。细胞培养21 d弃培养液, PBS漂洗2遍, 1%Triton X-100反复冻融3次, 细胞裂解物在37孵育于磷酸盐底物中30 min, 然后参加1 mol/L NaOH终止反响, 405 nm下测定吸光度值。 1.4.5、 采用Western blot法检测骨髓间充质干细胞中wnt信号通路相关蛋白含量 取第3代对数期的大鼠骨髓间充质干细胞, 以每孔2 104个接种于6孔培养板, 每孔2 mL, 待细胞贴壁后弃上清液, 根据实验分组给予0, 2, 5 nmol/L氯化锂干涉, 每孔2 mL。药物干涉2 d后, 提取各组细胞总蛋白进行蛋白定量, 经12.5%SDS-PAGE电泳分离, 转移至PVDF膜上, 用含5%脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲液室温孵育1 h后, 参加GSK3 , p-GSK3 , -catenin一抗4过夜, 用含吐温-20的TBS洗膜3次, 每次10 min, 加山羊抗兔二抗室温孵育1 h, TBST洗膜3次, 每次1 min, 参加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素, 室温孵育1 h, TBST洗膜3次, 每次10 min, 采用ECL法显色。凝胶成像系统摄片并分析, 结果以目的条带与内参条带 (GAPDH) 吸光度比值表示。 1.5、 主要观察指标 (1) 不同浓度氯化锂对骨髓间充质干细胞增殖作用的影响; (2) 不同浓度氯化锂对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响; (3) 不同浓度氯化锂对骨髓间充质干细胞中wnt信号通路相关蛋白含量的影响。 1.6、 统计学分析 所有数据均采用SPSS 22.0统计软件进行方差分析及t检验, 结果以 s表示, P 0.05为差异有显着性意义。 2、 结果Results 2.1、 骨髓间充质干细胞形态分析 接种24 h后可见少量星形、梭形细胞贴壁生长, 见图1A;培养6 d后可见梭形细胞呈现放射状排列, 见图1B。 2.2、 氯化锂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响 如表1所示, CCK-8法检测结果显示一定浓度的氯化锂能对骨髓间充质干细胞增殖产生促进作用, 并且不同浓度组的生长率差异有显着性意义, 细胞增殖率随着氯化锂的浓度升高而增加。 表1 不同浓度氯化锂对骨髓间充质干细胞增殖作用影响 ( s, n=8) 表注:与0 nmol/L比拟, aP 0.05。 2.3、 不同浓度氯化锂对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响 如此图2所示, 细胞汇合时均呈多层重叠生长, 细胞局部堆积成灶状, 构成钙结节, 茜素红染色后钙结节染成橘红色, 讲明此方式方法得到的细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。如此图3所示, 2, 5 nmol/L氯化锂组矿化结节与碱性磷酸酶活性均比空白组明显, 且5 nmol/L氯化锂的矿化结节与碱性磷酸酶活性更为显着。 2.4、 氯化锂对骨髓间充质干细胞中GSK3 , p-GSK3 , -catenin含量的影响 如此图4所示, 2, 5 nmol/L氯化锂能够显着增加p-GSK3 蛋白的含量, 而各组GSK3 蛋白含量差异无显着性意义;2, 5 nmol/L氯化锂能够显着提高 -catenin的含量。 3 、讨论Discussion 在哺乳动物整个生命周期中骨骼的不断更新经过称为骨重塑, 在这个经过中既包括破骨细胞骨吸收经过也包括成骨细胞骨再生经过21。生理条件下, 骨的吸收和构成处于平衡状态。随着年龄的增长, 骨吸收和骨构成的平衡被毁坏使得骨量减少。骨量及机械强度下降导致骨脆性增加构成的症候群称之为骨质疏松症。临床上治疗骨质疏松主要通过促进成骨细胞增殖分化22, 在骨微环境中骨髓间充质干细胞能够分化成为成骨细胞23。有报道指出, 锂具有提高骨髓间充质干细胞增殖的能力24。此研究也得到类似的结果, 不同浓度的氯化锂均具有提高大鼠骨髓间充质干细胞增殖的能力, 5 nmol/L氯化锂促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力最强。 研究发现锂钙复合盐具有促进大鼠骨髓间充质细胞向成骨细胞分化的作用25。在这里研究中, 对成骨细胞的钙化结节和碱性磷酸酶活性的研究结果发现, 5 nmol/L氯化锂能够明显加强大鼠骨髓间充质干细胞的矿化能力和碱性磷酸酶活性, 讲明氯化锂能够定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。该实验结果与王斌等14研究氯化锂具有诱导毛囊干细胞定向分化结果类似, 表示清楚氯化锂具有诱导干细胞定向分化的能力。 GSK3 是一种调节代谢的激酶, 也是wnt信号通路中关键的调节蛋白26,27。 -catenin是wnt信号通路中重要的下游功能性蛋白, 进入细胞核后能够诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化, 假如 -catenin遭到抑制则会导致骨质疏松28。GSK3 能够与 -catenin结合进而抑制wnt信号通路29。有研究表示清楚, 锂能够直接或间接抑制GSK3 的活性, 进而对wnt信号通路进行负调控30。Western blot结果发现不同浓度的氯化锂处理大鼠骨髓间充质干细胞能够明显增加p-GSK3 和 -catenin蛋白表示出, GSK3 蛋白表示出没有变化, 表示清楚氯化锂能够调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化相关蛋白p-GSK3 和 -catenin的表示出。综上所述, 氯化锂具有促进骨髓间充质干细胞增殖及诱导其向成骨细胞分化的能力, 其可能机制是通过调控Wnt/ -catenin信号通路相关蛋白表示出实现的。 图1 大鼠骨髓间充质干细胞形态 ( 100) Figure 1 Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells ( 100) 图注:图中A为培养1 d, 可见少量星形、梭形细胞贴壁生长;B为培养6 d, 可见梭形细胞呈现放射状排列。 图3 各组骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性Figure 3 Alkaline phosphatase activity of bone marrow mesenchymal stem cells 图注:与0 nmol/L氯化锂组比拟, aP 0.05。 图2 各组骨髓间充质干细胞钙化结节染色 ( 100) Figure 2 Calcified nodule staining of bone marrow mesenchymal stem cells ( 100) 图注:图中A-C分别为0, 2, 5 nmol/L氯化锂组, 由图可见2, 5 nmol/L氯化锂组矿化结节均多于0 nmol/L氯化锂组, 且5 nmol/L氯化锂组矿化结节最多。 图4 各组骨髓间充质干细胞中GSK3 、p-GSK3 、 -catenin蛋白含量 Figure 4 Expression of glycogen synthase kinase 3 , phosphorylated glycogen synthase kinase 3 and -catenin proteins in bone marrow mesenchymal stem cells 图注:与0 nmol/L氯化锂组比拟, aP 0.05。 图4 各组骨髓间充质干细胞中GSK3 、p-GSK3 、 -catenin蛋白含量 Figure 4 Expression of glycogen synthase kinase 3 , phosphorylated glycogen synthase kinase 3 and -catenin proteins in bone marrow mesenchymal stem cells 图注:与0 nmol/L氯化锂组比拟, aP 0.05。 以下为参考文献 1 Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL, et al. 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