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病毒感染过程中病毒锌指蛋白的功能研究,病毒学论文摘 要： 锌指(zinc fingers, ZF)构造是一种广泛存在于动植物、微生物包括很多病毒中的蛋白构造，肽链中氨基酸残基的特征基团与Zn2+结合进而稳定构成一种很短的、可自我折叠成“手指 形状的多肽空间构型。具有ZF构造的蛋白被称为锌指蛋白(zinc-finger protein, ZNF),研究发现，部分病毒能够编码具有ZF构造的蛋白且该蛋白会影响到病毒的复制、成熟病毒粒子的包装释放、调节激活病毒转录和裂解性感染及协助病毒的先天免疫逃逸等。本文就当前病毒的ZNF在病毒感染经过中发挥作用的研究进展作一综述，为ZNF的深切进入研究及以ZNF为靶位点的抗病毒药物研制提供参考。 本文关键词语 : 锌指蛋白;锌指;病毒感染， Abstract： Zinc finger(ZF) structure is a kind of common protein structure widely existing in animals, plants, microorganisms including many viruses. The characteristic group of amino acid residues in the peptide chain combines with Zn2+, thus forming a very short peptide space configuration which can self fold into finger shape. Zinc-finger proteins(ZNF) are proteins with zinc finger structure. It has been found that some viruses can encode zinc finger proteins, which can affect virus replication, packaging and release of mature virus particles, regulate and activate virus transcription and cleavage infection, and assist virus in innate immune escape. In this paper, the research progress of the role of ZNF in the process of virus infection is reviewed, which provides a reference for the further study of ZNF and the development of its targeting antiviral drugs. Keyword： zinc finger protein; zinc fingers; viral infection; 锌指(zinc fingers, ZF)构造是一套广泛的蛋白构造元件，其通过结合Zn2+来稳定一种很短的能够自我折叠的蛋白构造1,锌指蛋白(zinc-finger protein, ZNF)是迄今在真核生物基因组中分布最广的蛋白之一2,可见ZF构造在真核生物生命进程中扮演着特别重要的角色。很多病毒可以以编码具有ZF构造的蛋白且该构造的改变会影响病毒的生物学特性，本文对常见的病毒ZF构造蛋白在病毒感染中所发挥作用的研究进展作一综述，以期为ZNF的研究提供参考。 1 、锌指蛋白的构造与种类 锌指(zinc fingers, ZF)构造是一种通过肽链中的半胱氨酸或组氨酸与锌离子结合后自我折叠构成的指状空间构造3,其定义为：在一段氨基酸序列中，有几个固定位置的半胱氨酸(cysteine, C)残基或组氨酸(histidine, H)残基，这些残基与Zn2+特异性结合后，肽链旋转折叠构成一种稳定的三维手指状构造，这一构造被称为ZF构造4。锌指蛋白(zinc-finger proteins, ZNFs)通常是指由一系列具有重复构造的ZF构造组成的蛋白质，可与DNA、RNA以及其他蛋白相结合并产生互相作用，进而对生物的生命经过起到调节作用，在真核生物中研究颇为广泛5。非洲爪蟾卵母细胞中的转录因子TF IIIa(transcription factor IIIa)是第一个被鉴定为含有ZF构造的蛋白6,7,自此，研究人员开场对该领域展开研究。越来越多的研究表示清楚，很多病毒可以以编码合成ZNF,且该蛋白构造的改变会影响病毒的生物学特性，可见ZNF在病毒生命周期中扮演着特别重要的角色8。当前，已经知道的ZF构造有很多种类，根据其保守构造域的不同以及半胱氨酸和组氨酸的数目和位置，可分为C2H2、C2HC、C3H、C4、C6、C4HC3、C3HC4、联合型等多种类型9。最为常见的是C2H2型ZF,该ZF含有两个半胱氨酸与两个组氨酸，分别与锌离子络合后通过1个螺旋与2个反向折叠构成一个手指状构造10。 2 、病毒锌指蛋白在病毒感染中的作用 病毒感染是指病毒通太多种途径侵入机体，在易感宿主细胞中增殖并释放到细胞外再侵入邻近细胞的经过。当前，发现能编码ZNF的病毒包括：1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、鼠白血病病毒(MuLV)、猴免疫缺陷病毒 (SIV)、部分疱疹病毒(herpes virus)、冠状病毒(CoV)11、虾白斑综合征病毒(WSSV)12等。下文将对当前病毒的ZNF在病毒感染中所发挥作用的研究进展进行概述。 2.1、 逆转录病毒锌指蛋白对病毒感染的影响 逆转录病毒侵入宿主后，在逆转录酶的作用下，以病毒基因组RNA为模板合成cDNA,之后再以该DNA为模板进行转录、翻译等一系列生命活动13。绝大部分逆转录病毒的核衣壳蛋白(nucleocapsid, NC)域包含12个ZF构造-C2HC(图1),ZF之间由基本序列29RAPRKKG35连接14,该构造高度保守，对病毒基因组RNA组装期间的辨别和包装具有重要作用，介入病毒的早期感染15,16。 图1 NC区域ZF构造示意图17 Fig.1 Schematic diagram of ZF structure in NC region17 研究证明，逆转录病毒的NC蛋白构造域能够与病毒编码的Tat蛋白产生互作，NC蛋白通过在胞质中堆积来阻碍Tat蛋白介导的病毒mRNA的转录以及翻译，进而调节病毒的复制18。NC蛋白还能与宿主蛋白Alix发生互相作用，Alix是一种内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT),介导内吞小泡出芽和多泡体(multivesicular bodies, MVBs) 的构成19,其拥有2个构造域：N端回形域Bro1和中心V型构造域，NC蛋白能够与Bro1相结合，介入病毒的释放20。 2.1.1、 人类免疫缺陷病毒NC蛋白 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的NC蛋白是HIV的Gag蛋白的前体多蛋白(pr55 Gag)的N末端蛋白21,22。pr55 Gag蛋白介入构成寡聚体支架，促进病毒基因组RNA的组装，构成新的感染颗粒23,24,是病毒在反转录经过中的主要构造蛋白。病毒组装集中在病毒衣壳的主要构造蛋白Gag蛋白上，该蛋白是一个55 ku的多聚蛋白25,包含4个主要的子域，即基质(MA)、衣壳(CA)、核仁(NC)和p6。华而不实，NC在病毒粒子的组装、萌芽以及成熟阶段皆具有重要功能。首先，作为逆转录病毒的复制核心蛋白，NC在其内部稳定的ZF基序作用下可行使核酸伴侣功能，即与基因组RNA构成二聚体，并促进其反转录的发生26,27,28。其次，NC蛋白能募集大量宿主蛋白，包括肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白、亲环蛋白A、泛素以及赖氨酰-tRNA合成酶和很多RNA结合蛋白29,30,华而不实，双链RNA结合蛋白Staufen131是一种介入mRNA转运和翻译的宿主因子，NC蛋白与Staufen1互相作用调节病毒复制周期中的多个步骤，如Gag多聚化和基因组RNA衣壳化。Gag介导子代病毒颗粒衣壳的构成32,33, NC蛋白通过激活PKR和毁坏多囊泡来诱导病毒组装的发生，Staufen1通过结合和隔离NC蛋白并与RNA结合进而稳定多核糖体来毁坏NC诱导的病毒粒子装配。研究表示清楚，T细胞是HIV感染的靶细胞，通常在淋巴器官中呈极化形态，极化T细胞具有前缘区与尾足区两端，HIV的Gag会在其尾足区富集。受感染的T细胞通过富集有Gag蛋白的尾足与未感染T细胞接触，这个接触区域可能在病毒胞间传递中起着重要作用34,被称为病毒突触(virological synapse, VS)。Llewellyn等35发现，NC蛋白能驱使Gag在极化的T细胞尾足区富集，促进VS的构成，为病毒的胞间感染传播提供平台，而NC蛋白的缺失将导致病毒胞间传递受阻。NC蛋白含有两个ZF构造域36,Boutant等37通过对该区域进行两种突变，分别将核衣壳蛋白ZF域23位和44位的半胱氨酸替换为组氨酸，电镜下观察病毒的包装经过并未出现问题，但胞间感染能力却大大降低。相关研究证明，NC蛋白内源性逆转录(reverse transcription, ERT)是部分RNA病毒的一种逆转录方式38,NC蛋白ZF构造的突变会导致病毒的蛋白酶失活，使病毒拷贝数明显下降39,这讲明HIV病毒的NC蛋白内源性逆转录与病毒感染性之间存在因果关系。 2.1.2、 小鼠白血病病毒Ncp10蛋白 小鼠白血病病毒(murine leukemia virus, MuLV)是一种可引起小鼠白血病和神经系统疾病的逆转录病毒40,其核衣壳蛋白Ncp10的ZF构造最早于1995年被Darlix等41发现并报道，Gorelick等42对该病毒核衣壳区域ZF构造进行了两种突变：CCCC和CCHH,两种突变病毒都可正常组装基因组，但是突变病毒的碱基出现缺失，DNA复制能力大幅降低，证明在MuLV感染宿主时，其NC蛋白中完好且严格保守的ZF构造是病毒复制所必需的。Gorelick等43,44还对MuLV的核衣壳蛋白中的一个C2HC ZF构造进行了两种点突变，使原39位的半胱氨酸突变为组氨酸以及使原来34位的组氨酸突变为半胱氨酸，结果证明，两种突变体病毒都能够表示出出正常数量的Gag前体蛋白以及Env包膜蛋白，且突变株均包含了病毒的全长RNA,但是两株突变体无法合成cDNA, 感染能力仅为亲本株的4×10-4倍，即几乎没有感染能力。除了对ZF构造的突变，Housset等45针对ZF侧碱性氨基酸也进行了突变，通过使用中性氨基酸将15到18位的ERRR残基以及4042位的PKK残基进行多种替换和突变，发现当用1或2个中性氨基酸取代原来的碱性残基后并不会影响成熟病毒粒子的产生，但病毒的胞间传播能力皆减弱，当超过2个基本残基被中性氨基酸取代时，逆转录起始及基因组RNA二聚体包装发生严重缺陷，病毒胞间传播极度减弱。这些结果讲明，NCp10 ZF区域的稳定是MuLV感染性病毒粒子增殖所必需的。 2.1.3、 猴免疫缺陷病毒NC蛋白 Gorelick等46对猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)的核衣壳区域两个ZF构造进行了9种突变，所得到的突变病毒均可表示出出正常的病毒蛋白，且表示出量与亲本株没有显着差异，电镜观察所有突变病毒都具有与亲本株中未成熟病毒粒子类似的形态，然而，突变体的体外复制能力却明显下降，其感染性是野生型病毒的10-510-6倍。华而不实一个缺失了第2个ZF区域第33到第36位氨基酸的突变体病毒静脉注射到豚尾猕猴体内时，病毒丧失了感染能力。这讲明SIV核衣壳蛋白ZF突变体病毒在体外和体内均存在复制缺陷。为了找出突变病毒失去感染性的原因，Akahata等47还进一步通过定量PCR检测了SIV感染细胞不同时间后突变病毒cDNA的合成量，证明了ZF构造突变体病毒感染能力减弱，部分原因是病毒cDNA合成减少以及基因组RNA的包装效率降低。Yovandich等48构建了6株在NC区域2个ZF中半胱氨酸残基被删减或替换的SIV突变病毒，这些突变体病毒均存在复制缺陷，通过电镜观察发现，点突变或缺失病毒的表型类似，与野生型病毒粒子相比，病毒粒子含有浓缩的核，核的电子密度更小；ZF远端的突变以及两种ZF中的点突变都可导致Gag蛋白的加工不完好，病毒粒子中的全长基因组RNA的转录水平降低约30%;同时，ZF中半胱氨酸残基以及它们之间的基本链接区域缺失的突变体病毒能够有效的完成Gag前体蛋白的加工，但其基因组RNA的包装仅仅为野生型病毒水平的10%,所产生的病毒粒子颗粒在大小和核心形态上也是异常的。这些结果表示清楚，ZF构造基序的完好是Gag前体的正常加工和NC蛋白稳定表示出的前提，也是影响病毒感染能力的重要因素。 2.2、 疱疹病毒锌指蛋白对病毒感染的影响 2.2.1、 疱疹病毒US10 蛋白 研究证明，HSV-149、ILTV50、DPV51,52,53的US10蛋白均含有13个氨基酸构成的保守序列，经揣测，该序列编码的氨基酸最终表示出为C2H2型ZF构造蛋白。Ma等54通过细菌人工染色体55(bacterial artificial chromosome, BAC)平台构建了鸭瘟病毒US10基因缺失毒株，在感染鸭胚细胞后发现，该重组病毒的滴度下降了10100倍，但定量检测显示，缺失株与亲本株的基因组拷贝数无明显差异，揣测US10蛋白的ZF构造主要影响疱疹病毒感染性病毒粒子的包装，对其基因组的复制无明显影响。 2.2.2 、疱疹病毒UL52蛋白 单纯疱疹病毒1型(HSV-1)编码了一种由UL5、UL8和UL52编码蛋白组成的解旋酶/引物酶异源三聚体复合物。作为大型多蛋白分子复合物的一部分，解旋酶和引物酶在构造和功能上存在关联，并与其他几个复制体蛋白互相作用56。UL52蛋白C端含有保守的引发酶基序，华而不实包括一个ZF基序。然而，HSV-1和HSV-2 的UL52蛋白在986位置是一个亮氨酸残基，大多数其他疱疹病毒在这个位置是一个苯丙氨酸残基，Chen等57将该位置的亮氨酸替换为苯丙氨酸，发现突变体病毒引发酶的活性大幅降低(约为野生型的25%)。由于该突变位点位于UL52的ZF构造中，能否是该突变引起ZF构造和功能的改变，进而导致UL52功能变化有待考证，以及该ZF构造对引发酶的详细影响机制，还需做更深一步探究。 2.2.3、 单纯疱疹病毒1型的ICP0蛋白 HSV-1的ICP0蛋白是病毒立即早期基因ICP0编码的一种重要的转录调控蛋白，可刺激潜伏状态病毒发生增殖性感染。该蛋白具有一段C3HC4ZF构造域，早期研究发现，定点突变该构造域中任何一个半胱氨酸或组氨酸都将导致病毒转录激活失败，并且ICP0的核内定位发生改变58。牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus 1,BoHV-1)属于疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科成员，是一种疱疹病毒病59。在BoHV-1 ICP0基因中有一段ZF序列-C3HC4,该ZF被以为用于激活病毒胸苷激酶(TK)基因启动子进而激活病毒的增殖性感染，Inman等60首先报道该ZF构造对病毒的毒力具有重要作用，缺失了356677位氨基酸的ZF构造突变将导致ICP0的亚细胞定位发生改变，无法激活TK启动子。Saira等61将该ZF构造中51位半胱氨酸突变为甘氨酸，发现相对于正常的BoHV-1,突变病毒表示出了更多的ICP0蛋白，但检测到其在牛的细胞中的病毒滴度却有下降，并且其表示出的突变蛋白无法反式激活病毒TK的启动子，表示清楚ICP0高度保守的ZF构造对激活病毒转录和病毒裂解性感染至关重要。 2.3 、其他病毒锌指蛋白对病毒感染的影响 尼多病毒(Nido viruses)目编码的一种非构造蛋白，在动脉病毒中被称为nsp10,在冠状病毒中被称为nsp14,包含一个解旋酶域和N端锌结合域 (ZBD)62。研究证明，小动脉病毒的nsp10 ZBD突变体(Ser-59Pro)的解旋酶活性遭到显着毁坏，导致基因组mRNA合成缺乏。在反向遗传学研究中，大多数这些ZBD突变使该病毒无法生存63。马动脉炎病毒(equine arteritis virus, EAV)的nsp10的ZBD对病毒复制也是必不可少的64。Seybert等65构建了38种nsp10 ZBD突变体，ZBD 突变体具有复制和转录能力，但不产生传染性子代病毒，且EAV ZBD突变体mRNA的转录水平降低到正常水平的1%下面，这讲明EAV的ZF对于该病毒的感染性至关重要。严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)的nsp14构造域包含5条链组成的折叠66, 在-折叠片的两边都存在ZF,外切核糖核酸酶(ExoN)的活性依靠于非构造蛋白nsp14中ZBD的存在67,68,nsp14的ZBD位点突变毁坏了nsp14 ZF构造，导致nsp14酶活性减弱，表示清楚SARS-CoV的ZNF在催化病毒RNA合成中具有一定调节作用69。总的来讲，病毒的ZF构造能够通过对病毒解旋酶活性的调控作用介入病毒的基因组复制或者转录经过，进而对病毒的生命周期起到调节作用，影响病毒感染的效率。 2.4、 病毒锌指蛋白介入天然免疫调节 2.4.1、 猪繁衍与呼吸综合征病毒nsp1蛋白 猪繁衍与呼吸综合征是由猪繁衍与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的妊娠母猪繁衍障碍和仔猪呼吸道异常感觉和状态为特征的一种传染病70。NLRP3炎性体作为先天免疫的重要组成部分，在宿主抗病毒免疫中发挥着极其重要的作用71,72。研究表示清楚，PRRSV能够激活NLRP3炎性小体，诱导促炎性细胞因子IL-1分泌73。PRRSV的非构造蛋白1(nsp1)是病毒的重要免疫抑制蛋白，可抑制IFN-转录和TNF-的产生等74,75,其N端有一个ZF构造域76,王超等77,78通过删除或突变该ZF域氨基端，发现突变体没有能阻止poly(I:C)诱导炎症小体启动子的激活并释放干扰素。该研究初次表示清楚，nsp1有能力抑制NLRP3 炎症体所介导的干扰素分泌，且ZF构造的高度保守对nsp1抑制NLRP3介导的干扰素释放至关重要。但是，该ZF构造在nspl行使功能时所起到的详细作用机制还有待探究。 2.4.2、 人巨细胞病毒US10蛋白 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)入侵宿主后，能够干扰T细胞的辨别功能以及自然杀伤细胞(nature kill, NK)的毒性作用，进而介入免疫逃避作用79,80。NK细胞的激活取决于外表受体HLA-G,HLA-G可抑制外周血NK细胞对型人类B细胞系721.221的杀伤作用81,82。Park等83研究发现，HCMV的US10蛋白定位于细胞内质网，能够干扰HLA-G在内质网的加工经过，降低HLA-G在膜外表的表示出量，使NK细胞免疫作用紊乱，进而完成病毒免疫逃避。 2.4.3、 冠状病毒nsp14蛋白 冠状病毒 (CoV) 非构造蛋白 14 (nsp14)是复制-转录复合物的一部分。SARS-CoV 的nsp14 构造中存在3个ZF84,它是一种双功能酶，具有 3 到 5外切核糖核酸酶 (ExoN) 和鸟嘌呤-N7-甲基转移酶 (N7-MTase) 活性85,86。nsp14 N7-MTase 活性对防止宿主免疫系统辨别病毒 RNA 至关重要87。Case等88使用传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为Alphacoronavirus模型，构建了一组nsp14点突变病毒，华而不实ZF 1 (ZF-C)的特定突变体(rTGEV-ZF-C)与亲本病毒相比，rTGEV-ZF-C导致细胞病变效应和细胞凋亡水平降低，在感染后期dsRNA 积累水平降低，导致干扰素(IFN-)、肿瘤坏死因子(TNF)刺激基因拷贝数降低，都证实了该突变体引发的宿主抗病毒反响水平降低。总体而言，该研究揭示了ZF 在病毒抵抗天然免疫反响中的潜在作用。这为抗病毒策略提供了新的思路。 3、 展 望 ZF特殊的空间构造使得它能够与特定的核酸或者蛋白互相作用，对病毒在感染宿主细胞中具有重要作用。当前，对ZNF的研究主要集中于抗病毒以及抗癌方面的研究89,90,91,92,93,研究证明，某些Cys-Cys-Cys-His(CCCH)型ZNF,在免疫系统中起重要作用94,对病毒ZF构造和功能的深切进入研究，有利于人们理解病毒在宿主体内的感染机制，也有利于抗病毒药物的研发。靶向ZF基序的化合物可废除逆转录病毒(如HIV-1和MuLV)的感染性，但是单纯靶向于ZF的药物无法鉴别宿主与病毒的ZF,毒性较大具有明显副作用，这也是当前没有研发出高安全性的商品化药物的原因之一。相信将来研究人员会攻克这一难题。 以下为参考文献 1 0GO 0 A.TYSON J,COCKELL S J,et al.The zinc finger protein ZNF658 regulates the transcription of genes involved in zinc homeostasis and ffects ribosome biogenesis thro ugh the zinc transcriptional regulatory elementJ.Mol Cell Biol,2021,35(6):977987. 2 NAJAFABADI H S ALBU M,HUGHES T R. 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