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盐藻细胞DsRab蛋白的诱导表达及纯化,基因工程论文盐生杜氏藻Dunaliella salina，下面简称盐藻的细胞构造简单，具有很强的抗盐能力，能够生长在 5.0 mol/L NaCl 培养液中，而且其培养条件也很简单。因而，盐藻是研究植物耐盐分子机制的重要形式生物。研究表示清楚当盐藻在高盐环境胁迫下，体内的蛋白质合成和降解以及能量代谢等多种代谢途径会发生很大程度的改变，华而不实耐盐作用主要是依靠盐藻中 Na+/H+泵和大量合成兼容性溶质甘油，但应答盐胁迫的调控经过还少有报道。从信号传导方面开展对盐藻抗盐生理调节经过的研究，有助于全面了解盐藻耐盐机制。 小 G 蛋白Small GTP-binding proteins分子量一般在 20-30 kD 之间，以单体形式普遍存在于真核生物中，通过激活态结合 GTP与非激活态结合 的转变来行使分子开关作用，介入重要的细胞生理活动，包括信号传导、细胞增殖、囊泡转运、细胞骨架重组等。Rab 蛋白是小 G 蛋白家族Ras、Rho、Rab、Arf/Sar 和 Ran 5 个亚家族中最大的亚家族，近年来在酵母、果蝇、拟南芥、烟草、水稻等真核生物中发现的 Rab 蛋白遍布于胞内的各个膜区室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab 蛋白定位于特定的细胞器膜上，介入膜泡的构成、定向转运、锚定链接等经过。现已发现很多与植物的抗逆性有关的 Rab 蛋白，其表示出量会遭到盐胁迫、低温、干旱等逆境条件的影响。因而，深切进入了解 Rab 蛋白功能及进一步研究植物抗逆性相关蛋白的互相作用网络具有重要科学意义。 本实验室已从盐藻细胞中成功克隆出新的 Rab蛋白基因DsRabGenBank Accession No.JN989548，并用实时荧光定量 PCR 方式方法研究了DsRab基因在盐胁迫下的表示出情况，证明DsRab是一个盐诱导上调基因。本试验构建重组表示出载体 pGS-21a-DsRab，通过优化诱导表示出条件使 DsRab 蛋白在上清中的表示出量增加，利用 GST-SefinoseTMKit 纯化，获得纯度较高的可溶性融合蛋白，为制备抗体以及进一步在蛋白质水平上研究该蛋白在盐藻耐盐性机制中的作用奠定基础。 1、材料与方式方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和质粒 大肠杆菌E.coli菌株 DH5 、E.coliBL21DE3、 质粒 pGS-21a 由本室保存；pMD18-T Simple Vector 购自 TaKaRa 公司。 1.1.2 试剂 限制性内切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4 连接酶购自 TaKaRa，硝酸纤维素膜、Anti-GSTAntibody、HRP-IgG、沉淀型单组分 TMB 底物溶液购自 TIANGEN，GST-SefinoseTMKitBSP032-7，Pr-estained Protein Molecular Weight Marker 购自生工生物工程上海有限公司，凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。 1.2 方式方法 1.2.1 原核表示出载体的构建 根据DsRab基因 cDNA全长序列GenBank Accession No.JN989548设计引物并参加酶切位点，上游引物含EcoR I 酶切位点P1 ：5 -CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC-3 ，下游引物含 SalI 酶切位点P2 ：5 -GTCGA-CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3 。以总 RNA 反转录的 cDNA 为模板，P1，P2 为引物进行 PCR 扩增。扩增条件 ：94预变性 5 min ；94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 1 min，35 个 循环 ；72延伸9 min。扩增产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，回收目的片段，连接到 pMD18-T simple 载体上T-A克隆，构建重组质粒 pMD18-DsRab，转化 E.coliDH5 感受态，在 Amp 抗性平板上挑选阳性单克隆。用EcoR I、SalI 双酶切目的片段和 pGS-21a 质粒，用 T4 连接酶连接，构建表示出载体 pGS-21a-DsRab，转化E.coliDH5 感受态，挑选阳性单克隆，交由大连宝生物公司测序，以验证读码框的正确性。 1.2.2 融合蛋白的原核表示出 将测序鉴定正确的表示出质粒 pGS-21a-DsRab 转化 E.coliBL21DE3，挑取阳性单克隆，接种于 5 mL 含氨苄青霉素50mg/L的 LB 液体培养基中，37过夜培养。次日，按 1% 的比例接种到 5 mL 新的 LB 液体培养基氨苄青霉素 50 mg/L中，37振荡培养到菌液OD600=0.6-0.8 时，试验组参加终浓度为 1 mmol/L 的IPTG，对照组不加 IPTG，37诱导 6 h。离心收集菌体，用 0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，4、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，加上样缓冲液，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检测。 1.2.3 融合蛋白表示出条件的优化 按 1.2.2 一样方式过夜培养的菌液，1% 的比例转接到新的 LB 液体培养基氨苄青霉素 50 mg/L中，37振荡培养到菌液 OD600=0.6-0.8 时，进行分组培养 ：IPTG 终浓度梯度为 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 mmol/L ；诱导温度梯度为 25、28、30、35 和 37 ；培养 6 h。离心收集细菌，0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，离心取上清，用 SDS-PAGE 检测。 1.2.4 重组蛋白的纯化 优化表示出条件下，将过夜培养的菌液按 1% 的比例接种于 100 mL 的 LB 液体培养基含氨苄青霉素 50 mg/L中，37振荡培养至菌液 OD600=0.6-0.8，参加终浓度为 0.1 mmol/LIPTG 诱导表示出，28振荡培养 6 h。4、8 000 r/min离心 3 min，收集细菌，用 20 mL 0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，4、12 000 r/min 离心 20 min，取上清并用 0.45 m 滤膜抽滤。用 GST-SefinoseTMKit 纯化，SDS-PAGE 电泳检测。 1.2.5 Western blotting 检测 纯化后的融合蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，电转移至 NC 膜200 mA，2h，用 5% 牛血清白蛋白 4封闭过夜，参加一抗Anti-GST Antibody12 000，37孵育 1 h，0.01mmol/L PBST 洗涤 3 次，每次 5 min，然后参加二抗 HRP-IgG1200，37 孵 育 1 h，0.01 mmol/LPBST 洗涤 3 次，每次 5 min，然后参加沉淀型单组分 TMB 底物溶液显色。 2、结果 2.1 原核表示出载体的构建 经 PCR 扩增获得一条 600 bp 左右的条带图1-A，与预期片段大小一致。EcoR I、SalI 双酶切重组质粒 pGS-21a-DsRab，结果图 1-B表示清楚目的片段已与 pGS-21a 质粒正确连接，重组质粒能够用于测序。测序结果表示清楚扩增片段与DsRab基因开放阅读框完全一致，读码框正确，原核表示出载体 pGS-21a-DsRab 构建成功。 2.2 融合蛋白的原核表示出 对照组表示出菌含有空载体 pGS-21a诱导后，在 35 kD 左右有一条表示出加强的标签蛋白条带，含有重组质粒的表示出菌诱导后在 57 kD 左右有一条明显表示出加强的条带，此条带在对照组没有出现，与预期结果相符融合蛋白包括估计分子量为 22 kD的 DsRab 蛋白和 35 kD 的标签蛋白图 2-A。结果还显示，上清和沉淀均可见清楚明晰的目的蛋白条带，表示清楚目的蛋白为部分可溶性表示出。 2.3 融合蛋白表示出条件的优化 电泳结果显示，诱导剂 IPTG 的浓度在 0.1-1.0mmol/L 范围内，融合蛋白的表示出量没有太大变化图2-B。在 25、28、30、35 和 37 5 个诱导温度下，融合蛋白的表示出量比拟，在 28诱导时，融合蛋白的表示出量最大图 2-C。在最优条件下，融合蛋白的可溶性表示出量显著增加图 2-D。 2.4 重组蛋白的纯化及鉴定纯化产物经 SDS-PAGE 检测，在 57 kD 左右有单一蛋白条带，表示清楚融合蛋白被有效纯化图 3-A。Western blotting 检测图 3-B显示，融合蛋白能与抗 GST 单克隆抗体特异性结合，具有良好的免疫学活性，表示清楚融合蛋白在E.coliBL21DE3中成功表示出。 3、讨论 高盐环境下，植物对盐胁迫的应答是非常复杂的经过，牵涉一系列与抗逆性相关的信号传导经过。研究表示清楚 Rab 蛋白作为一种分子开关蛋白，分布于胞内所有的亚细胞构造，不同的 Rab 蛋白与相应的上游调控因子和下游效应因子互相作用，介入了胞内几乎所有的膜运输经过。近来大量研究报道证实有些 Rab 蛋白与植物的高盐适应性有关。 Mazel 等将拟南芥AtRab7在转基因植物中表示出，加速了转基因植物根、叶和原生质体中的胞吞作用，对盐和浸透胁迫的耐受性提高。O Mahony 等在牧草Sporobolus stapfianus中发现的 sRab2 可能牵涉由植物 ABA 介入的耐旱信号的传导。水稻在冷冻、干旱及生长激素 ABA 存在的条件下，OsRab7基因的 mRNA 含量呈现不同的趋势；高盐胁迫下，普通冰草Rab5B、烟草PgRab7、花生AhRab7基因的表示出量都有增加。 在高度耐盐的形式生物盐藻中，有关 DsRab 蛋白的研究鲜有报道。本实验室已经克隆得到盐藻新基因DsRab，并初步证明该基因与盐藻耐盐性有关，为进一步研究 DsRab 蛋白在盐藻抗盐应答中的作用，获得高纯度的可溶性的 DsRab 蛋白是非常重要的。 本试验中融合蛋白的表示出选用经典的大肠杆菌原核表示出系统，表示出的融合蛋白在细胞的上清和沉淀中均有存在，讲明融合蛋白以可溶性及包容体形式表示出。为了获得大量的可溶性蛋白，对诱导剂浓度和诱导温度两个表示出条件进行了优化。华而不实诱导剂IPTG 在 0.1-1.0 mmol/L 范围内，融合蛋白表示出量相差不大，为尽可能减少包容体形式的蛋白表示出，诱导剂的浓度越小越好。试验中的 5 个诱导温度比拟，28时蛋白的表示出量最大。所以确定的最优表示出条件是 0.1 mmol/L IPTG，28，诱导培养 6 h。 本试验中纯化的可溶性 DsRab 蛋白能够用于挑选与该蛋白可能发生互相作用的蛋白质，进一步了解 DsRab 上下游的作用因子。为深切进入研究盐藻DsRab 蛋白在抗盐方面的作用，可以以在转基因的植物中过量表示出该蛋白，检测转基因植物的高盐适应性。这些结果，不仅为下一步制备抗体并进一步研究 DsRab 蛋白在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础，而且为该类蛋白在植物抗逆中的作用提供了新的信息。 4、结论 成功的构建了盐藻 DsRab 蛋白的原核表示出载体pGS-21a-DsRab，并在大肠杆菌 E.coliBL21DE3表示出体系中成功表示出，优化诱导表示出条件后，纯化上清蛋白，获得了纯度较高的可溶性融合蛋白。Western blot 初步证明该融合蛋白就是带有 GST 标签的 DsRab 蛋白。 以下为参考文献： 1Jia Y, Xue L, Li J, et al. 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