小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫发育形态变化,动物学论文.docx

小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫发育形态变化,动物学论文胚胎心脏内部分隔起始于房室管心内膜垫的构成与融合，将房室管分隔为左、右房室孔，心内膜组织增生构成房室瓣1,2.除此之外，房室管心内膜垫也介入心房、心室的分隔。房室管心内膜垫与心房原发隔、心背侧间充质突等融合异常可导致房间隔缺损、室间隔膜部缺损和单一房室管心内膜垫等畸形3,4,因而，研究房室管心内膜垫的正常发育经过对讨论心脏内部分隔机制具有重要意义。已证实房室管心内膜垫的构成始于房室管内皮细胞的内皮-间充质转化 endothelial-mesenchymal transformation,EMT ,心肌细胞对此经过起诱导作用2,5.当前相关研究多侧重于揭示心肌细胞诱导内皮细胞进行间充质转化所通过的信号通路6 9,有关小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫融合经过中的形态学变化报道较少。本研究旨在观察和讨论胚龄 9 13d 小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫发育经过的形态学变化及其意义。 材料和方式方法 1. 标本制作 3 月龄健康雌性中国昆明小鼠 20 只，体质量23 30g,由山西医科大学实验动物中心提供，动物许可证号： SCXK晋2018-0001.动情期与同种雄鼠交配过夜，次晨发现阴栓者为妊娠 0. 5d.妊娠小鼠乙醚麻醉后剖腹收集胚龄 9 13d 胚胎共 30 只，经甲醇 丙酮 水 2 2 1 v/v 混合固定液固定 24h,脱水、透明、石蜡包埋，制作 7 m 厚连续切片，用于HE、免疫组织化学染色。另收集胚龄 12d、12. 5d、13d 小鼠胚胎各 5 只，体视显微镜下分离心脏，戊二醛、锇酸双重固定，环氧树脂包埋，制作半薄切片和超薄切片。 2. 免疫组织化学染色 12O2和TENG-T 10mmol / L Tris,5mmol / L EDTA,150mmol / LNaCl,0. 25% gelatin,0. 05% Tween-20,pH 8. 0 各处理 30min,用以减低内源性过氧化物酶活性和非特异性背景染色。处理后切片分别用小鼠抗 -平滑肌肌动蛋白 -smooth muscle actin, -SMA,1 1000,1A4,Sigma 公司 、小鼠抗心肌肌球蛋白重链 myosin heavy chain,MHC,1 1000,Upstate 公司单克隆抗体和兔抗磷酸化组蛋白 H3 phosphorylatedhistone H3,PHH3,1 100,Cell Signaling 公司 多克隆抗体室温孵育过夜。再依次用兔抗小鼠 IgG 17500,荷兰阿姆斯特丹大学 Lamers WH 教授赠送 抗 PHH3 抗体孵育的切片省去兔抗小鼠 IgG 孵育步骤 、羊抗兔 IgG 1 250,荷兰阿姆斯特丹大学Lamers WH 教授赠送 和兔过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物 1 750,Nordic 公司 孵育。DAB 显色，常规脱水、透明、封片。 3. 电子显微镜切片的制备 包埋后的小鼠胚胎心脏制作半薄切片，甲苯胺蓝染色后观察定位，分别选取胚龄 12d、12. 5d、13d小鼠胚胎心脏房室管心内膜垫相互接近部位，心内膜垫内皮相贴部位，两侧房室管心内膜垫相互融合部位，制作 50 80nm 厚超薄切片，经醋酸双氧铀、枸橼酸铅双重染色后，在透射电子显微镜下观察并摄片。 结 果 1. 房室管心内膜垫的构成 胚龄 9d,心管正在成襻，心房已移至心室背侧头端。心房与心室之间可见稍有缩窄的房室管。心管壁由心肌，内皮以及两者之间的心胶质构成 图1A .房室管的心胶质已增厚，但未见间充质细胞出现 图 1A 1D .心胶质外表的内皮细胞多为扁平细胞，核椭圆形 图 1B,箭头 .胚龄 10d,心管成襻完成，构成四腔心，心房、心室尚未进行内部分隔。房室管偏存心脏左侧，与左心室相通。房室管心胶质内开场出现散在分布的间充质细胞，提示房室管心内膜垫构成 图 2A 2E .与流出道相邻的一侧心内膜垫称为腹侧心内膜垫，对侧则称为背侧心内膜垫。腹侧心内膜垫所在的房室管心肌细胞并未向心内膜垫内延伸，该侧心内膜垫体积较小，所含间充质细胞也较少； 而背侧心内膜垫对应的房室管心肌与心室小梁心肌形态类似，并向心内膜垫内有明显延伸， -SMA、MHC 染色阳性 图 2B,2F,2G ,同时连续切片观察显示背侧心内膜垫明显大于腹侧心内膜垫，所含间充质细胞较多 图 2A,2B,2D,2E .心内膜垫与间充质细胞密切相邻的内皮细胞增高 图 2C .心内膜垫内未见 -SMA或 PHH3 阳性细胞 图 2F,2H . 胚龄 11 12d,房室管右移，背、腹侧心内膜垫体积增大，并变得对称 图3A,3B ,房室管壁 MHC、 -SMA 阳性心肌细胞不再向心内膜垫内延伸 图3C,3D .垫内间充质细胞较胚龄 10 天增加 图2B,3A,3B ,偶见 -SMA 阳性细胞，但未构成致密细胞团 图3D,箭头 .心内膜垫内可以见 PHH3 阳性细胞 图3E,箭头 .透射电子显微镜下观察心内膜垫内间充质细胞散在分布，形态各异，胞质内可见粗面内质网、线粒体等细胞器 图 3F . 2. 房室管心内膜垫的融合 胚龄 12 13d,两侧房室管心内膜垫相互接近开场融合。首先表现为两侧心内膜垫外表的内皮相互相贴 图 4A ,此时内皮细胞呈立方形，核质比增大，细胞质内可见线粒体、粗面内质网等细胞器，未见细胞凋亡 图 4B .两侧心内膜垫内间充质细胞散在分布，部分相邻细胞的细胞膜相互相贴，细胞间隙消失，但细胞连接少见。胞质内仍可见粗面内质网、线粒体 图 4C,4D .相互相贴的房室管心内膜垫内皮消失后，两侧垫内的间充质细胞相互相混，这些细胞并未构成致密漩涡状构造 图 5A .透射电子显微镜观察相邻细胞的细胞膜相互相对，可见较狭窄的细胞间隙 图5B ; 部分间充质细胞相邻细胞膜局部构成细胞连接 图 5C,箭头 .胞质内可见粗面内质网、线粒体等细胞器，但未观察到丰富的微丝 图 5C . 图 1 胚龄 9d 横切面 心房与心室之间可见稍有缩窄的房室管，房室管壁由心肌，内皮以及两者之间的心胶质构成，心胶质内未见间充质细胞； 心胶质外表的内皮细胞多为扁平细胞 B,箭头 ; 心肌 -SMA、MHC 染色阳性 C,D ; B 为 A 的局部放大 A、C、D 标尺示 100 B 标尺示50 m图2 胚龄 10d 横切面 房室管心胶质内出现散在分布的间充质细胞； 连续切片观察腹侧心内膜垫体积较小，所含间充质细胞也较少； 而背侧心内膜垫体积较大，所含间充质细胞较多 A,B,D,E ; 与间充质细胞密切相邻的内皮细胞增高 C,箭头 ; 背侧心内膜垫相邻的房室管心肌细胞 -SMA、MHC 染色阳性，并向心内膜垫内有明显延伸 F,G,箭头 ; 心内膜垫内未见 -SMA 或 PHH3 阳性细胞 F,H ; B、C 为 A 的局部放大，E 为 D 的局部放大，B、E G 中虚线示内皮； H 中虚线所框区域为房室管壁 A、D 标尺示 200 B、E H 标尺示 100 C 标尺示 50 m 讨 论 1. 房室管心内膜垫的构成 1. 1 房室管心内膜垫构成经过中内皮细胞的形态学变化： 房室管壁内皮细胞受心肌细胞诱导进行内皮-间充质转化 EMT1,2,5,6,产生的间充质细胞进入内皮与心肌之间的心胶质内，介入构成心内膜垫。 斑马鱼胚胎心脏研究证实内皮细胞在进行内皮-间充质转化时的首要表现为形态改变，即由扁平变为立方形10.本实验结果显示，小鼠胚龄 10d,房室管心胶质内已经开场出现间充质细胞，此时内皮细胞已变为立方形，提示小鼠胚胎与斑马鱼类似，在内皮细胞进行 EMT 时同样会发生形态改变。但我们注意到胚龄 12d,在房室管心内膜垫相互接近的经过中，心内膜垫外表的内皮细胞持续表现为立方形，排列严密，且胞质内可见细胞器，并未发生凋亡。房室管心内膜垫融合前内皮细胞的这一形态学改变的意义尚需进一步讨论。 1. 2 两侧房室管心内膜垫构成不同步： 胚龄 9d,房室管的心胶质明显增厚，这是心内膜垫构成的首要表现，继而房室管内皮细胞开场 EMT,介入构成心内膜垫。有研究以为，鸡胚心脏房室管背侧心内膜垫的构成早于腹侧11,但对斑马鱼胚胎的研究结果恰与之相反，即腹侧心内膜垫构成早于背侧10.而本实验连续切片观察显示，小鼠胚胎发育第 10 天，背侧心内膜垫体积明显大于腹侧心内膜垫，所含间充质细胞也较多，提示两侧房室管心内膜垫的构成并不同步，背侧早于腹侧，与鸡胚类似。大量研究证实，房室管心肌细胞可释放 Tbx2 等一些信号分子通过激活转化生长因子 2、Has2 或通过其他信号通路促使内皮细胞进行 EMT,因而，房室管心肌细胞对心内膜垫的构成具有诱导作用7,12.本实验结果显示，较早构成的背侧心内膜垫对应的房室管心肌有 -SMA 阳性心肌细胞呈小梁状延伸入心内膜垫内，由此揣测延伸入心内膜垫的这些心肌细胞对内皮细胞进行间充质转化的诱导作用，导致背侧心内膜垫构成较多的间充质细胞。而此期在腹侧房室管心肌无延伸现象，故对应的心内膜垫内间充质细胞也较少，所以我们揣测背侧房室管心内膜垫构成早于腹侧可能是由于两侧心肌细胞诱导作用存在时间差。胚龄 11 d,心内膜垫内观察到 PHH3 的散在表示出，讲明间充质细胞可通过增殖增加其数量。因而，此期胚胎小鼠心脏房室管心内膜垫体积较胚龄 10d明显增大，间充质细胞数量增加，且两侧基本对称，并相互接近。 2. 房室管心内膜垫的融合 房室管心内膜垫融合将房室管分隔为左右房室孔，心内膜垫则重塑为左右房室瓣1,2.因而，房室管心内膜垫的正常发育对胚胎心脏内部分隔的完成具有重要意义，但现有研究对两侧心内膜垫的融合经过报道较少。另一方面，胚胎心脏在进行内部分隔经过中构成的心内膜垫包括流出道心内膜垫和房室管心内膜垫各一对，两对心内膜垫各自对向生长、融合，分别分隔流出道和房室管13,但两部位的心内膜垫融合经过能否一样有待证实。因而本课题组在前期对流出道心内膜垫发育进行观察的基础上讨论了房室管心内膜垫的融合经过。结果显示，光学显微镜下相互相贴的房室管心内膜垫在其内皮消失后，两侧垫内的间充质细胞相互相混，这些细胞并未构成 -SMA 阳性致密漩涡状构造。而在流出道，融合的心内膜垫可见间充质细胞聚集构成 -SMA阳性漩涡14.透射电子显微镜下观察，房室管心内膜垫融合时间充质细胞部分相邻细胞之间可见较狭窄的细胞间隙； 仅部分间充质细胞相邻细胞膜局部构成细胞连接。胞质内可见粗面内质网、线粒体等细胞器，但未观察到丰富的微丝。因而房室管心内膜垫融合时所含间充质细胞的超微构造与融合前类似。这与流出道心内膜垫融合时间充质细胞之间细胞连接丰富，细胞质内微丝较融合前明显增加的形态特点明显不同14.其原因可能是由于流出道心内膜垫的间充质细胞来源于内皮细胞和神经嵴细胞的分化，后者在垫内聚集构成漩涡状构造，表示出较强的 -SMA.而房室管心内膜垫间充质细胞来源于内皮细胞，缺乏神经嵴细胞的介入，因而融合经过中间充质细胞形态特点与流出道心内膜垫存在差异。