陈皮经黑曲霉发酵后的体外抗氧化活性分析,生物制药论文.docx

陈皮经黑曲霉发酵后的体外抗氧化活性分析,生物制药论文内容摘要：目的：考察黑曲霉发酵对陈皮黄酮类成分及抗氧化活性的影响。方式方法：采用超高效液相色谱法(UPLC)及紫外分光光度法(UV)对发酵前后黄酮类成分含量进行测定，采用去除1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基、2,2 -联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基进行抗氧化活性评价。结果：发酵陈皮黄酮类成分含量及抗氧化能力较未发酵陈皮均有提高，且随着发酵时间延长，总黄酮、橘皮素含量及去除DPPH自由基能力呈现先增后减趋势，橙皮苷、川陈皮素含量及去除ABTS自由基能力则一直呈现上升趋势。结论：黑曲霉发酵可提高陈皮黄酮类成分含量及抗氧化活性，发酵时间对其影响显著。本文关键词语：陈皮; 黑曲霉; 黄酮类; 抗氧化活性;Effects of Aspergillus niger fermentation on flavonoids and antioxidant activity of pericarpium citri reticulatae(PCR)YANG Dan YANG Fangqing YAN Nana CHEN Hongping LIU YoupingDepartment of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Standardization Education Ministry Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Breeding Base of State Key Laboratory of Resources System Research and Development Utilization of Chinese Herbal Medicines Co-constructioned by The Ministry of Science and Technology of the PRC and Sichuan ProvinceAbstract：Objective: To study the effect of Aspergillus niger fermentation on flavonoids and antioxidant activity of PCR. Methods: The content of flavonoids before and after fermentation was determined by UPLC and UV, and the antioxidant activity was evaluated by scavenging free radicals of 1,1-diphenyl-2-hydrazidyl(DPPH), 2,2 -diazo-di3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid(ABTS). Results: The content of flavonoids and antioxidant capacity of fermented PCR were increased compared with those of unfermented. With the prolonged fermentation time, the content of total flavonoids, tangeratin and the ability to scavenge DPPH free radicals increased first and then decreased, while the content of hesperidin and nobiletin and the ability to scavenge ABTS free radicals increased all the time. Conclusion: Aspergillus niger fermentation can improve the content of flavonoids and antioxidant activity of PCR, and the fermentation time has a significant effect on it.陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的枯燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰之成效1。黄酮类成分作为陈皮主要活性成分之一，主要包含黄酮、黄酮醇、黄烷酮(橙皮苷、新橙皮苷)、多甲氧基黄酮(川陈皮素、橘皮素、3,5,6,7,8,3 ,4 -七甲氧基黄酮)等。当代药理研究表示清楚，其不仅对消化系统及心血管系统疾病有较好的治疗作用，还具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抑菌等多种生物活性2。已有文献考察陈皮黄酮类成分的抗氧化活性3,4,5,6，结果均表示清楚其具有较好的抗氧化能力。黑曲霉因其强大的酶系及安全性，在发酵工业生产中广泛应用，已有研究报道银杏叶7、黄芪8、瞿麦9等经黑曲霉发酵后其黄酮含量和抗氧化能力均有提高。当前有研究表示清楚陈皮经细菌发酵后其抗氧化活性有所提高10，课题组前期研究也表示清楚黑曲霉发酵后的陈皮对氧化性肝损伤小鼠的保卫作用加强11，但尚未对黑曲霉发酵后陈皮的体外抗氧化活性进行考察。因而采用黑曲霉对陈皮进行发酵培养，通过测定发酵前后黄酮类成分含量，比拟发酵前后的抗氧化活性，包括对DPPH自由基及ABTS自由基的去除作用，以期为陈皮的下一步开发利用提供理论根据。1 材料与方式方法1.1 材料与仪器陈皮样品为课题组前期在四川省成都市金堂镇收集，经成都中医药大学药学院中药鉴定教研室严铸云教授鉴定，为芸香科植物大红袍C.reticu1ata Dahongpao 的枯燥成熟果皮。黑曲霉：课题组前期从陈皮中分离纯化而来，低温保存；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、2,2 -联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Trolox(水溶性VE)、甲醇(分析纯)、过硫酸钾：国产试剂；橙皮苷对照品(纯度98.76%，批号：MUST-18032502)、川陈皮素对照品(纯度99.46%，批号：MUST-14100814)、橘皮素对照品(纯度99.77%，批号：MUST-17050902)：成都曼思特生物科技有限公司。Multlskan Mk3酶标仪：赛默飞世尔仪器有限公司；智能人工气候箱：浙江托普云农科技股份有限公司；BP211D电子分析天平：德国Sartorius股份有限公司；Agilent 1290超高效液相色谱仪：美国Agilent科技有限公司；UV-1100型紫外-可见分光光度计：上海天美科技有限公司。1.2 方式方法1.2.1 黑曲霉发酵陈皮称取8 g陈皮样品粉末样品平铺于培养皿中，紫外线照射灭菌30 min，翻面，继续照射30 min。将灭菌好的样品分为对照组和发酵组。发酵组：每培养皿精致细密参加1 mL标准黑曲霉孢子悬浮液；对照组：精致细密参加1 mL无菌水。编号标记，每个样品3个平行。将2组样品置于人工气候箱中30、95%RH恒温恒湿培养，分别于发酵第5、7、9、11、13天进行取样。1.2.2陈皮黄酮类成分含量测定供试品溶液制备以下为参考文献12：精致细密称取陈皮样品粉末约0.2 g，参加甲醇25 m L，称重，在75下水浴回流1 h，冷却，用甲醇补重，过滤，即得供试品溶液。1.2.2. 1 总黄酮含量测定总黄酮测定方式方法以下为参考文献12：以橙皮苷为对照品溶液做标准曲线，以橙皮苷浓度为横坐标(X)、吸光度值为纵坐标(Y)，做线性回归，得回归方程为Y=29.636X+0.0079,R2=0.9999。精致细密量取供试品溶液0.2 mL，定容至10 mL容量瓶中，置于紫外分光光度计中，在283 nm波长下进行测定。根据标准曲线计算总黄酮含量。1.2.2. 2 3种黄酮类成分含量测定3种黄酮类成分测定方式方法根据课题组前期建立方式方法13，略做调整：色谱柱为Boston PHlex ODS(4.6 mm 250mm,5 m)；流动相采用0.1%磷酸水-乙腈(B)，按下面梯度程序洗脱：010 min,2030%B;1020 min,3050%B;2025 min,5052%B;2530 min,52%B;3035 min,5295%B;3537 min,95%B，后运行5 min；柱温30；流速0.7 mL/min；检测波长283 nm及335nm；进样量：5.0 L。取供试品溶液过0.22 m微孔滤膜，按选定的色谱条件测定陈皮样品中3种黄酮类成分的含量。1.2.3 抗氧化活性测定1.2.3. 1 DPPH自由基去除能力测定以下为参考文献14，略做调整。D P P H自由基储备液：称取0.0631 g DPPH，用适量甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，摇匀，作为储备液(16 mmol/L)低温避光保存备用。取l mL DPPH储备液用甲醇定容至100 mL，得到160 mo1/L DPPH溶液。取1.2.2项下供试品溶液(浓度为8.0 mg/mL)依次稀释至0.8、3.2、4.8、6.4、8.0 mg/mL。样品组(A1)：以不同浓度提取液为样品溶液，汲取20 L，加样于96孔板中，再参加180 L DPPH溶液；对照组(A2)：汲取样品溶液20 L，加样于96孔板中，再参加180 L甲醇溶液；空白组(A0)：汲取20 L甲醇，加样于96孔板中，再参加180 L DPPH溶液。充分混匀后，室温避光反响30 min，置于酶标仪中，于517 nm波长处测定，记录吸光度值。每个样品设3个复孔，取平均值。根据系列浓度下的去除率，计算出到达半数去除率浓度(IC50)。其IC50值越小，其抗氧化能力越强。提取物去除DPPH自由基的能力按下式计算：1.2.3. 2 ABTS自由基去除能力测定根据文献3,15的方式方法略做调整。ABTS混合液的制备：将5 mL7 mmol/L ABTS水溶液与88 L 140 mmo1/L过硫酸钾水溶液混合，将混合液在室温避光条件下放置1216 h，构成ABTS自由基储备液。将此工作液与甲醇按体积比混合，在734 nm下调吸光度为0.700 0.02，得到ABTS混合液，于30下预热备用。于96孔板中加10 L样品溶液与200 L ABTS混合液，室温下避光30 min后在734 nm下测定其吸光值，每样品设3个复孔。以Trolox为阳性对照做标准曲线，测定结果用每克陈皮中所含Trolox当量来表示( mol TE/g)。1.2.4 数据统计与分析所有数据均为3次实验的平均值 标准偏差，利用Excel 2022对数据进行图表绘制，利用SPSS 22.0对数据进行分析。2 结果与分析2.1 陈皮黄酮类成分测定结果黑曲霉发酵前后陈皮黄酮类成分含量测定结果见表1。表1 黑曲霉发酵陈皮前后黄酮类成分含量测定结果注：各发酵时间与5 d比拟，*P 0.05,*P 0.01。根据表1结果能够看出，发酵陈皮各黄酮成分含量均高于未发酵陈皮。随着发酵时间的延长，未发酵陈皮样品各黄酮成分含量变化不明显，发酵陈皮各黄酮含量随时间延长有明显变化：总黄酮含量和橘皮素含量呈现先升后降的趋势，在发酵第11天时含量最高，但在第13天有降低趋势；橙皮苷含量和川陈皮素含量则一直呈现上升趋势，发酵第13天与第5天相比含量均有显著性提高。讲明黑曲霉发酵可提高陈皮中总黄酮及3种黄酮类成分含量。2.2 黑曲霉发酵前后抗氧化活性测定结果2.2.1 DPPH自由基去除实验结果黑曲霉发酵前后陈皮去除DPPH自由基能力如此图1图2所示。图1 陈皮发酵前后对DPPH自由基的去除能力(发酵5 d)图2 黑曲霉发酵对陈皮去除DPPH自由基的影响注：各发酵时间与5 d比拟，*P 0.05,*P 0.01。以下图同。从图1能够看出，发酵陈皮与未发酵陈皮对DPPH自由基均有一定的去除作用，并且发酵陈皮与未发酵陈皮提取液浓度与其对DPPH的去除能力均呈现显著的量效关系，随着提取液浓度的增加，其对DPPH自由基的去除能力也逐步加强。IC50值越小，到达半数去除率所需样品浓度就越低，讲明其去除效果越强。从图2能够看出，发酵陈皮对DPPH自由基去除能力较未发酵陈皮强，华而不实未发酵陈皮随发酵时间延长去除作用变化不明显，而发酵陈皮随发酵时间延长到达半数抑制率的IC50值有减少趋势，讲明其去除作用有所加强。但是发酵陈皮的IC50值呈现先减后增趋势，在发酵第9天时，IC50值最低，其对DPPH自由基去除作用最强。2.2.2 ABTS自由基去除实验结果黑曲霉发酵前后陈皮对ABTS自由基去除结果如此图3所示。图3 黑曲霉发酵对陈皮去除ABTS自由基的影响每克陈皮中所含Trolox当量越大，其抗氧化能力越强。根据图3可知，发酵陈皮与未发酵陈皮对ABTS自由基均有一定的去除作用，未发酵陈皮随着时间延长，Trolox当量变化不明显，而发酵陈皮的Trolox当量有显著的增长趋势。讲明黑曲霉发酵对陈皮去除ABTS自由基能力有一定影响，并且随发酵时间延长，其去除作用进一步加强。采用黑曲霉发酵陈皮，考察黑曲霉发酵对陈皮总黄酮、橙皮苷、川陈皮素及橘皮素含量和抗氧化活性的影响。结果表示清楚，陈皮经黑曲霉发酵后，其黄酮类成分含量及抗氧化活性较未发酵陈皮均有所提高，发酵时间对其影响显著。华而不实，橙皮苷、川陈皮素含量及去除ABTS自由基能力随发酵时间延长呈现上升趋势，而总黄酮、橘皮素含量及去除DPPH自由基则是先增后减。本文初次对黑曲霉发酵陈皮的体外抗氧化活性进行研究，发酵后的陈皮抗氧化活性加强，可能与其黄酮类成分含量及组分变化有关，后期亦检测出有新的黄酮类组分增加，华而不实的内在联络还需要进一步的研究。但黑曲霉发酵能使陈皮的抗氧化活性加强，这可为陈皮的进一步开发利用提供理论基础。以下为参考文献1国家药典委员会.中国药典(一部)M.北京:中国医药科技出版社,2021:191.2李伟伟,张国伟.陈皮黄酮类成分研究进展J.中国医学创新,2020,24(11):154-156.3高蓓.广陈皮黄酮类化合物和挥发油成分及其活性研究D.武汉:华中农业大学,2018.4童红梅.用HPLC检测不同成药时间陈皮中类黄酮含量及其抗氧化活性J.西部中医药,2020,25(7):17-19.5张海丽.陈皮提取物的抗氧化活性研究J.黑龙江医药,2020,27(2):306-309.6韩鹏虎,董树国,刘佳铭,等.均匀设计优化超声波辅助索氏提取陈皮的总黄酮及抗氧化性研究J.吉林医药学院学报,2021,37(2):101-104.7杨芳,赵崇妍,屈青松,等.银杏叶发酵研究进展J.中国当代中药,2021,20(8):1034-1038.8刁欢,张珍,余伟群,等.微生物发酵提高黄芪中黄酮类物质含量的研究J.长江大学学报(自科版),2021,14(8):4-7,3.9高晗,郭东会,张显忠,等.黑曲霉发酵法辅助提取瞿麦黄酮及抗氧化活性研究J.安徽农业科学,2021,45(32):142-143,220.10段志芳,张少平,付莉,等.枯草芽孢杆菌发酵陈皮对其提取物抗氧化活性的影响J.食品科技,2021,43(5):259-264.11张鑫.基于真菌与陈皮药效物质相关性研究陈皮陈化机制D.成都:成都中医药大学,2021.12韦正,陈鸿平,杨丽,等.不同贮藏年限广陈皮中辛弗林及总黄酮含量变化规律研究J.辽宁中医杂志,2020,40(5):982-985.13刘荣,韦正,樊丹青,等.不同栽培品种橘皮中主要活性成分的动态积累J.中国实验方剂学杂志,2020,20(15):111-117.14黄周锋,蒋珍藕,胡筱希,等.基于DPPH去除自由基的两面针果壳提取物抗氧化活性评价J.中医药导报,2021,24(21):75-77.15史辑,黄玉秋,范亚楠,等.巴戟天不同炮制品抗氧化作用比拟研究J.医学研究杂志,2021,46(01):42-45.