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生鲜瓜果微生物检测中液相色谱法的应用,分析化学论文摘 要： 随着国民生活水平的提高和食品工业的迅速发展，食品质量安全越来越遭到人们的关注。与此同时，食品安全问题越来越突出，尤其是生鲜瓜果中过量或违规使用食品添加剂是常见的现象，因而，各级检验机构面临着越来越严峻的检测任务。为了更好地实现生鲜瓜果微生物检测，一般采用液相色谱法对食品微生物进行检测。在这里基础上，分析液相色谱法在生鲜瓜果微生物检测中的作用，以期为食品检测提供一定的方式方法学支撑。 本文关键词语： 液相色谱法; 生鲜瓜果; 微生物检测; 效果分析; 随着国民生活质量的改善，人们对食品质量的要求也越来越高，不仅要吃得好，还要吃得健康。但是，随着一系列食品安全问题的曝光，将食品安全问题推到了风口浪尖，生鲜瓜果食品的质量问题也得到了国民群众的关注。在检测生鲜瓜果食品方面，由于食品样品的基质较为复杂，微生物含量没有一定的标准，检测工作更是困难重重。而液相色谱法是一种高效、经济、简捷、灵敏、检测结果准确度高的检测方式方法，为生鲜瓜果食品微生物检测工作提供了强有力的技术支持。基于此，以液相色谱法在生鲜瓜果食品微生物检测中的效果为主，进行分析研究，希望能够为食品检测工作提供一些方式方法上的借鉴。 1 、液相色谱法检测生鲜瓜果食品中的微生物 高效液相色谱法又叫做高效液相层析法，是在20世纪六七十年代发展起来的一种新型的分离分析方式方法。随着技术的不断改良和完善，高效液相色谱法已经广泛应用于食品、环境、医疗药物、生物以及工业等诸多领域，成为微生物检测分离分析的重要技术。根据分离机制的不同，高效液相色谱法能够分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法，液相色谱法的具体分类如表1所示。高效液相色谱法的检测工作一般是通过一套科学完好的系统进行，该系统由输液泵、进样器、色谱柱、检测仪器、数据记录以及处理装置等组成。高效液相色谱法在技术应用上，一方面把流动相变为高压输送；色谱柱是由小粒径的填充材料加上特殊的填充方式方法制成的，这一方式方法使得色谱柱的效果远远高于传统的色谱法1。另一方面，色谱柱后接有灵敏度极高的检测仪器，能够实现对流出物体的不间断检测。 表1 液相色谱分析法按分离机制的分类 1.1、 生鲜食品中微生物的检测 1.1.1 、样品前处理 样品的前处理对于检测精度、检测结果的准确度以及检测限都有着直接的影响，前处理步骤很大程度上决定了测定分析结果的质量高低，是整个分析分离检测经过中的关键因素之一。同时，样品的前处理是整个测定分析经过中最薄弱也是耗时最长的一个步骤，而且还对测定的分析效率和测定成本有着显着影响。生鲜瓜果食品由于基质复杂，其微生物含量的检测对样品前处理的要求更好。因而，液相色谱法采用的样品前处理技术选择的是简单、快速、经济、绿色的处理技术，不仅能够减少操作时间，降低检测成本，同时最大程度地避免了有机溶剂对环境造成的毁坏2。 检测仪器与设备：Waters 515高效液相色谱仪包括2487紫外检测器、二元梯度泵、手动进样器购自美国Waters公司；吉姆斯WQ-20超声波清洗器、吉姆斯TB-W涡旋器；ML3002电子天平购自梅特勒公司；检测试剂主要是甲醛、乙醛等十种醛类试剂3，均购自中国食品药品检定研究院。10种防腐剂储备液：称量苯氧乙醇与乙基己基甘油标准品10mg与量取液体标准品0.01m L于同一个10m L的棕色容量瓶中，甲醇稀释并定容，配制成1000?g/m L的储备液，于冷冻中避光保存备用。使用时用甲醇稀释所需质量浓度。甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯。 检测材料由扬州市石塔菜场的生鲜瓜果市场提供，主要的检测材料是番茄、胡萝卜、杏子、石榴、黑加仑、香梨、红枣。在准备好检测材料与试剂后，用移液枪准确量取醛类试剂各50微升放入安培瓶，用1毫升的乙腈进行溶解，得到检测需要的标准储备溶液与衍生试剂溶液。将需要检测的生鲜食品放入高速旋转不锈钢粉碎机进行粉碎处理，获得均匀的检测样品4。 1.1.2、 萃取衍生 通常生鲜瓜果食品微生物含量的检测工作中采用的是液相微萃取方式方法，这种方式方法在检测中能够通过分子印记聚合物辨别特定分子，实现样品萃取。但是分子印记聚合物的吸附能力取决于萃取物的属性并受周围环境浓度的影响5，富集效果良好，能够实现采样和浓缩的无缝衔接，具有低成本、操作简易、萃取效率高的优点。通过双通道气流吹扫微注射器萃取装置，将装有1毫升的萃取溶液的2毫升的注射器、50毫升的广口铝瓶以及气体流通系统组合而成。利用该萃取装置，将定量的样品放入铝瓶中，在加热的同时进行气流的吹扫，进而使得样品里的挥发性化合物质经过加热蒸发后被注射器里的溶剂吸收，萃取时间为30分钟，停止吹气后将注射器中的溶液取出来。用移液枪量取300微升的萃取溶液放入安培瓶中，按次序参加定量的衍生试剂，将安培瓶密封起来，旋转，使萃取溶液和衍生试剂均匀混合，将其放到设定好温度的水浴锅中进行完全反响6。取出安培瓶，衍生试剂冷却至室温后添加定量的乙腈，用有机过滤机器对萃取衍生后的溶剂进行过滤，然后进行液相色谱检测。 1.1.3、 液相色谱分析检测 通过液相色谱仪，利用色谱柱与梯度分析分离程序进行十种醛的衍生物的色谱分离。华而不实进行色谱分离的标准信息如表2所示。在一个样品分析检测完成之后，色谱柱需要用初始流动相平衡5分钟然后进行下一个样品的检测7。 表2 色谱分离标准信息 1.2、瓜果食品中微生物的检测 1.2.1 、样品前处理 将不同品种的水果存放到冰箱中冷藏，霉变后粉碎成浆状，混匀装入干净盛样容器内，编号标记。检测试剂有氨水与去离子水稀氨水等体积混合的稀氨水、甲醇、经过处理的定量的乙酸铵溶液、苯甲酸标准储备液、乙酰磺胺酸钾标准储备液、脱氢乙酸标准储备液以及混标使用液，这些储备液的纯度均到达100%8。高效液相色谱仪、电子天平、离心机、超声仪以及紫外可见分光光度计等仪器。称取定量的瓜果汁放入比色管中，调节PH值为7-8左右的稀氨水超声提取，添加去离子水使得溶液的体积到达25毫升并进行均匀的摇摆，采用微孔滤膜进行过滤。 1.2.2、 紫外波化学衍生 由于苯甲酸以及脱氢乙酸这些有机化合物在紫外区均有吸收，因此使用紫外检测器进行检测。利用紫外线可见分光光度计的特定波段对各组的标准溶液进行光谱扫描，最终的吸收光谱图如此图1、图2所示。 图2 脱氢乙酸吸光度图谱 从图1、图2中能够看出，苯甲酸和脱氢乙酸的最大吸收波长分别是226.5nm和235.5nm。波长在220nm附近，苯甲酸有良好的吸收,而脱氢乙酸有两个吸收峰，分别是235.5nm和296.0nmnm，但在波长在296nm附近只要脱氢乙酸有良好的吸收。因此选择中间波长230nm作为检测波长。在选择好检测波长之后，对流动相比例进行优化并进行流速确实定。最终检测选择使用甲醇和0.02mol/L乙酸铵溶液做流动相，流速则为1.0m L/min。除此之外，色谱柱的柱温保持在30摄氏度，进样量选择20?L的量器。确定好波长以及检测条件后，通过化学衍生，让那些既没有紫外吸收也不发荧光的分析物带上紫外吸收很强的基因，或者是具有荧光性能的发色分子团，进而将分析物转化为能够用作色谱法分析并进行检测的衍生物9。这样，通过化学衍生，使得食品微生物检测的灵敏度大大提高。 1.2.3 、高效液相色谱结果 利用溶液和流动相两者间的物理或化学差异性，当溶液从色谱柱流出时，分析色谱图上显现的相对应的色谱峰，进而也就获得了检测目的物的含量信息，详细的色谱结果参考图3。 图3 高效液相色谱图 2、 检测结果 液相色谱法对生鲜食品中的微生物含量的检测结果愈加科学准确，在这些检测样品中，大多数的样品中甲醛、戊醛和己醛含量较高10。详细的检测结果参考表3、表4。表中检测结果的单位均为?g?g?，ND表示未检测出。 表3 瓜果样品检测加标实验信息 表4 瓜果食品检测结果信息 由上述检测数据能够看出，采用双通道气流吹扫微注器萃取装置，进行萃取，然后经过化学衍生等操作，液相色谱法成功地检测到了生鲜瓜果食品中微生物的含量，这一方式方法富集效果良好，检测杂质干扰少，检测灵敏度高。并且，在引入的具备良好荧光性能的衍生试剂的作用下，萃取后的分析物有机萃取溶液能够实现直接的液相色谱检测。同时，气流吹扫微注射器萃取装置实现了与液相色谱的有机配合。 3、 生鲜瓜果食品微生物检测效果分析 3.1 、影响生鲜瓜果食品微生物检测效果的因素 3.1.1、 萃取条件 首先萃取条件对检测效果有着不可忽视的影响。气体流速吹扫注射器萃取的一个重要参数就是气体流速。通常，气体流速较小就需要相对较长的萃取时间，较大的气体流速则萃取的时间较短，但是气体流速过大就会导致检测分析物从萃取溶液中流失掉。气体流速控制在0.4-2.5m Lmin?的范围内则萃取效率会保持最优状态。并且，温度对萃取效率也有着一定的影响，当加热温度为150摄氏度时，检测目的的回收率到达理想状态。低于或高于150摄氏度，萃取效率或有所降低11。萃取溶剂对萃取效率同样也有影响。例如，水、甲醇、乙腈三种溶剂在实验中分别经过气流吹扫注射器进行萃取，甲醇和乙腈作为萃取试剂的萃取效率没有很大的差异不同，但是两者都比水作为萃取试剂的萃取效率更好。相比温度和气体流速，萃取试剂对萃取效率的影响更弱一点。其次是衍生条件的影响。为了保证检测样品能够被完全衍生，衍生试剂的量一定要充足。 3.1.2、 衍生试剂浓度与p H值的影响 同样，衍生试剂的浓度对衍生效率也会产生相应地影响。当添加的衍生试剂的量是检测样品总量的八倍时，衍生物的荧光强度开场趋于稳定状态，在这里基础上再增加衍生试剂的浓度时则不会对衍生效率造成太大的影响12。除此之外，在检测中使用的缓冲溶液的p H值对检测效果也有着一定的影响。p H值保持在9.5-10.5的范围内，能够实现化学衍生的最高产率。当p H值高于10.5以后，衍生物的峰面积会明显下降。 3.1.3 、搅拌速率的影响 搅拌速率会对衍生试剂浓度的均一性产生一定的影响，进而影响检测效果。适宜的搅拌效率能改变试剂浓度的均一性，速率过高超过一定的范围，不仅无法实现传质速率的增加，还有可能将附着在空气中纤维膜上的有机萃取溶剂溶解掉，造成萃取效率的降低。另一方面，搅拌速率过低，传质速率就会变得缓慢，甚至导致给出相的反萃取。有数据表示清楚，搅拌速率保持在600r/min时，萃取效率到达最高。 3.1.4 、色谱分离 最后是色谱分离环节。由于生鲜瓜果样品的分析物都是链脂肪醛，这些有机物质在反相色谱柱上很难被保存下来，因而会被很快地洗脱出来而在液相色谱分析不无法实现较好的分离。所以，通常在生鲜瓜果食品检测中，往往选择将衍生试剂的官能团引入到引入醛类化合物的分子中，这样能够增加食品分析物的疏水性，进而延长分析产物的保存时间，使得具有类似性质的醛能够实现很好地分离。但同时需要注意的是，甲醛和乙醛的保存时间都比拟短，这两种试剂的保存时间差异不同也不大，为了使这两种醛到达理想的分离度，通常在流动相中添加1%的甲酸，这样就能够改善甲醛和乙醛的峰形，使得这两种醛在较短的时间里得到完全的分析分离，在反相色谱柱上几乎没有保存的被洗脱出来。 3.2 、液相色谱法检测效果分析 液相色谱法主要是通过高压输液的方式实现对不同流动相的色谱分析分离，并且在分离之后利用检测器对分离的检测样品进行分析。这一方式方法是结合了气相色谱法和传统液相色谱法的优势，在两种方式方法的基础上发展起来的。液相色谱法有着无可比较的优势，其流动相是液体，所以能够省略气化步骤，这样就拓宽了液相色谱法的应用范围13。同时，这一方式方法所利用的硬件及其设备都是精到准确度极高的，保证了检测结果的分离效果、灵敏度和回收率，在提高检测结果准确性的同时实现了绿色检测。液相色谱法在检测条件优化的状态下，测定了生鲜瓜果食品微生物含量的线性、准确度和精到准确度，并且液相色谱法中的食品基质效应是检测生鲜瓜果食品中微生物含量的重要方式方法14。详细的液相色谱法对生鲜瓜果食品微生物含量检测的精到准确度、线性范围以及检出限信息参考表5。 表5 生鲜瓜果食品中醛类化合物检测精到准确度信息 以上述数据为参考，能够得出，液相色谱法在采用高压输液泵、全方位多孔微粒填充柱以及检测度极高的分离实现了对生鲜瓜果食品的测定，简化了测定步骤，减少了测定误差，极大地提高了分析精度。同时，运用液相色谱法还能够对获得的色谱检测图进行缩小、放大、叠加以及保存数据和峰值、峰面积的编辑处理15。液相色谱分析法对样品的适用性广泛，不受分析对象挥发性和热稳定性的局限，几乎所有的微生物化合物包括高沸点、极性、离子型化合物和大分子物质都能够采用液相色谱分析法测定。 4 、结束语 以液相色谱法在生鲜瓜果食品微生物含量的检测中的应用效果进行分析，我们得出，液相色谱法检测生鲜瓜果食品中的微生物含量需要经过样品前处理、萃取衍生、加标实验、色谱分离、效果分析等经过。同时液相色谱法在运用经过中受诸多条件的影响，如萃取温度、搅拌速率、衍生试剂浓度以及PH值等因素。综合来讲，液相色谱分析法是一种绿色、经济、简捷、检测效果优良的测定方式方法。但是，由于绝大部分食品的基质比拟复杂，要想使得液相色谱检测法在详细的分析分离实验中到达理想状态，还有待于进一步的探寻求索研究。 以下为参考文献 1张可可,赵光华,郝学飞,等.2021年郑州市即食生鲜果蔬病原微生物调查与风险分析J.河南预防医学杂志,2021,28(5):325-328. 2卢军,王舒琳.液相色谱在食品检测中的应用J.食品界,2021(6):113. 3苗辰.液相色谱法在食品检测中的应用进展J.食品安全导刊,2021(6X):105. 4徐静.高效液相色谱法在食品安全分析检测中的应用J.食品安全导刊,2021(6X):107. 5王志洁.浅谈高效液相色谱法在食品添加剂检测中的应用J.食品安全导刊,2021(33):64. 6陈辰.高效液相色谱法在食品添加剂检测中的应用与结果分析J.食品安全导刊,2021(30):112. 7张俊,赵玉玺,张爱凤,等.液相色谱-质谱/质谱法检测生鲜乳中黄曲霉素M1方式方法的建立J.黑龙江畜牧兽医,2021(7):226-228. 8程海燕,胡燕杰,周诗瑾.固相萃取-高效液相色谱法测定水产品中的乙烯雌酚残留量J.食品安全导刊,2021(12):80-81. 9 陈敏.高效液相色谱-串联飞行时间质谱高通量筛查生鲜乳中兽药残留J.食品科学,2021,39(22):302-311. 10马岩,马静,李莉,等.高效液相色谱测定生鲜乳甲砜霉素残留量的方式方法研究及应用J.宁夏农林科技,2021(1):24-27. 11王帅兵,曲斌,耿士伟,等.亲水作用色谱-高分辨质谱测定生鲜牛乳中7种氨基糖苷类药物残留J.动物医学进展,2021,38(9):67-72. 12于志鹏,樊玥,赵文竹,等.多维液相色谱及其在活性肽分离纯化研究中的应用进展J.食品工业科技,2021,38(11):327-331. 13赵玮.浅谈高效液相色谱(HPLC)法在食品检验中的应用J.食品安全导刊,2021,203(12):113. 14蒋孟圆,张瑞雨,刘晓松,等.二极管阵列-超高效液相色谱法同时测定食品中5种添加剂的含量J.食品安全质量检测学报,2021,8(10):127-133. 15杨昊,公丕学,王骏,等.植物性食品农药残留检测中高效液相色谱 串联质谱法的应用J.现代化工,2021,46(12):2532-2534.