咪达唑仑对肝癌细胞增殖、凋亡与细胞周期的影响,肿瘤学论文.docx
咪达唑仑对肝癌细胞增殖、凋亡与细胞周期的影响,肿瘤学论文摘 要： 目的 讨论静脉麻醉药咪达唑仑对人肝癌细胞增殖能力的影响。方式方法 首先通过CCK-8增殖实验观察递增浓度20、40、60、80和100 mol/L的咪达唑仑分别各自作用24、48和72 h后对人肝癌细胞的影响;通过流式细胞仪检测浓度为50 mol/L (Mida50组) 和100 mol/L (Mida100组) 的咪达唑仑以及PBS对照组 (Control组) 作用于人肝癌细胞发生的凋亡和细胞周期的变化;通过免疫印迹方式方法观察咪达唑仑对ERK通路的影响。结果 咪达唑仑浓度为20 mol/L递增至100 mol/L作用24 h时, 人肝癌细胞株Huh7细胞增殖生存率由 (88.55 5.64) %下降至 (47.71 4.45) %, 差异有统计学意义 (P 0.05) , 且浓度为100 mol/L的咪达唑仑作用24、48和72 h的增殖生存率分别为 (47.71 4.45) %、 (25.69 6.52) %和 (18.10 2.95) %, 差异有统计学意义 (P 0.05) 。流式细胞实验显示Mida50和Mida100组的早期凋亡和晚期凋亡比率分别为 (7.07 0.41) %和 (8.36 0.48) %以及 (7.58 0.47) %和 (13.44 0.67) %。细胞周期示Control组、Mida50组、Mida100组S期比例分别为 (22.19 1.07) %、 (27.57 2.15) %和 (38.11 1.25) %。免疫印迹结果显示咪达唑仑作用于人肝癌细胞会使p-ERK下调。结论 咪达唑仑在体外细胞实验中能抑制人肝癌细胞株Huh7细胞的增殖并呈浓度相关和时间相关, 华而不实可能与咪达唑仑促进其凋亡和细胞周期S期停滞相关, 相关机制可能是通过ERK通路实现的。 本文关键词语： 咪达唑仑; 肝细胞癌; 增殖; 凋亡; Abstract： Objective To investigate the effects of Midazolam on the proliferation of human hepatocellular carcinoma (HCC) cells.Methods CCK8 proliferation assay was used to observe the anti-tumor effects of Midazolam on HCC cells.Midazolam treatment were given at different concentrations, including 20, 40, 60, 80 and 100 mol/L, and for 24 h, 48 h and 72 h.The cell apoptosis and cell cycle of HCC were studied by flow cytometry.Western blotting was adopted to study the influence of Midazolam on ERK pathways.Results The cell viabilities of huh7 cells inhibited by Midazolam with concentrations of 20 mol/L and 100 mol/L were (88.55 5.64) % and (47.71 4.45) % in a concentration-dependent manner, and they were (47.71 4.45) %, (25.69 6.52) % and (18.10 2.95) % inhibited by Midazolam of 100 mol/L for 24 h, 48 h and 72 h, respectively (P 0.05) .Midazolam induced apoptosis, and suppressed cell cycle progression of huh 7 cells.The percentages of early apoptosis cells in Group Mida50 and Mida100 were (7.07 0.41) % and (7.58 0.47) %, respectively;as the late apoptosis percentages were (8.36 0.48) % and (13.44 0.67) %, respectively.The accumulation rates of live cells in S phase in Group Control, Mida50 and Mida100 were (22.19 1.07) %, (27.57 2.15) % and (38.11 1.25) %, respectively.Meanwhile, western blotting showed Midazolam induced down-regulation of p-ERK.Conclusion Midazolam is able to inhibit the proliferation of HCC cells, and to induce apoptosis and suppress cell cycle.ERK pathways may play a crucial role in this process. Keyword： midazolam; hepatocellular carcinoma cell; proliferation; apoptosis; 当前越来越多的研究提出麻醉能够影响手术患者, 十分是肿瘤手术患者远期预后这一观点。有研究报道外周血液里的肿瘤细胞数量在肿瘤患者的生存和预后起着重大的作用1。由此可见, 静脉麻醉药对肿瘤细胞的直接作用是特别重要的。咪达唑仑 (midazolam) 作为常用的静脉麻醉药, 由于它的起效快, 镇静效果显着等作用也被常用于肿瘤患者术前、麻醉诱导及围术期的镇静。近年来, 有研究发现咪达唑仑能抑制肿瘤细胞生长和促进凋亡2。肝细胞癌是全球回归性分析指出吸入麻醉药与静脉麻醉药相比, 术中使用吸入麻醉药维持麻醉的患者病死率更高层次4。静脉麻醉药具有这种优势的原因当前还未明了, 但是可能与免疫功能调节和肿瘤生长因子的影响有关。咪达唑仑是一种常用的静脉麻醉药, 广泛用于术前诱导和镇静5。当前已有报道描绘叙述了咪达唑仑能够促进睾丸间质肿瘤细胞的凋亡2, 但它在肝细胞癌中的影响仍然未有报道。 肝细胞癌作为全球第二大常见肿瘤, 并且近年来肝细胞癌的发生率有上升的趋势5, 所以在肝细胞癌的诊疗上很重要的一环是寻找其发生发展的相关机制。当前公认的华而不实一种肿瘤靶向治疗是有关于凋亡的, 尤其在肝细胞癌中凋亡是华而不实一个很重要的机制6。本研究通过体外细胞实验证明咪达唑仑具有抑制肝癌细胞生长的潜能, 并且也证明了咪达唑仑能促进肝癌细胞发生凋亡和细胞周期停滞。 图4 免疫印迹检测咪达唑仑对Huh7细胞的ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平的影响 当前已有研究证明咪达唑仑具有影响肿瘤的潜在作用。Mishra等7研究显示咪达唑仑能够促进淋巴瘤细胞和肠癌细胞的凋亡并且其细胞周期停留于S期, 这一结果与本研究结果相一致。Chen等8也报道了瞬时受体蛋白M型能够逆转咪达唑仑引起的恶性胶质瘤细胞增殖减少这一效应, 也间接证明了本研究结果的可靠性。咪达唑仑作用的受体于外周是作用于外周型苯二氮艹卓类受体 (peripheraltype benzodiazepine receptor, PBR) 。已有报道PBR介入很多细胞活动, 华而不实包括细胞增殖、细胞死亡、氧化应激以及肿瘤的增殖和凋亡9。当前仍然鲜有报道咪达唑仑与PBR在细胞增殖, 尤其肿瘤增殖和凋亡上的关系, 所以咪达唑仑能否作用于PBR影响肿瘤的发生、发展仍然需要研究去验证。MAPKs信号通路在细胞生长, 诱导分化增殖和生存具有重要的作用10。本研究发现咪达唑仑作用于人肝癌细胞会使其p-ERK蛋白水平下调。Li等11研究显示咪达唑仑能够通过JNK-ERK通路减少运动神经的氧化应激水平。由于氧化应激广泛出如今肿瘤细胞, 包括肝细胞癌, 并且使其发生细胞凋亡和细胞周期停滞12, 所以我们以为咪达唑仑可能是通过ERK信号传导通路影响肝细胞癌的增殖, 凋亡和细胞周期。 肝细胞癌当前主要的治疗手段仍然是手术切除, 由于麻醉与手术的密切关系, 在肿瘤患者的手术中麻醉用药就显得特别重要。贯穿整个围术期, 包括术前诱导、术中及术后的辅助镇静, 咪达唑仑是一种暂不可取代的静脉麻醉药。在本研究中, 我们使用咪达唑仑作用于人肝癌细胞, 发现咪达唑仑能浓度依靠性和时间依靠性地抑制肝癌细胞的生长, 并从细胞凋亡和细胞周期的角度出发, 也发现了咪达唑仑具有诱导凋亡和细胞周期停滞的潜能。除此之外, 免疫印迹的结果发现咪达唑仑能够抑制肝癌细胞ERK的磷酸化。 综上所述, 在体外肝癌细胞实验中, 咪达唑仑可能通过ERK通路影响人肝癌细胞的增殖, 凋亡和细胞周期, 提示咪达唑仑在肝癌患者的手术中使用是有益的, 为日后肝癌患者手术的麻醉药物的选择提供了新的根据。 以下为参考文献： 1Matsushita D, Uenosono Y, Arigami T, et al.Clinical Significance of Circulating Tumor Cells in Peripheral Blood of Patients with Esophageal Squamous Cell CarcinomaJ.Ann Surg Oncol, 2021, 22 (11) :3674-3680. 2So EC, Chen YC, Wang SC, et al.Midazolam regulated caspase pathway, endoplasmic reticulum stress, autophagy, and cell cycle to induce apoptosis in MA-10 mouse Leydig tumor cellsJ.Onco Targets Ther, 2021, 27 (9) :2519-2533. 3Maluccio M, Covey A.Recent progress in understanding, diagnosing, and treating hepatocellular carcinomaJ.CA Cancer JClin, 2020, 62 (6) :394-399. 4Wigmore TJ, Mohammed K, Jhanji S.Long-term Survival for Patients Undergoing Volatile versus IV Anesthesia for Cancer Surgery:A Retrospective AnalysisJ.Anesthesiology, 2021, 124 (1) :69-79. 5康凯, 孙彤, 陈明.地佐辛联合咪达唑仑持续泵注在ICU机械通气中的镇静效果J.广东医学, 2021, 36 (21) :3296-3298. 6刘清, 罗永胜, 王伟, 等.凋亡素联合阿霉素与顺铂对肝细胞癌的凋亡作用研究J.广东医学, 2018, 30 (7) :1035-1037. 7Mishra SK, Kang JH, Lee CW, et al.Midazolam induces cellular apoptosis in human cancer cells and inhibits tumor growth in xenograft miceJ.Mol Cells, 2020, 36 (3) :219-226. 8Chen J, Dou Y, Zheng X, et al.TRPM7 channel inhibition mediates midazolam-induced proliferation loss in human malignant gliomaJ.Tumour Biol, 2021, 37 (11) :14721-14731. 9Casellas P, Galiegue S, Basile AS.Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial functionJ.Neurochem Int, 2002, 40 (6) :475-486. 10王伟飞, 王新颖, 姜泊.以MAPK通路为靶向的肿瘤生物治疗J.广东医学, 2018, 30 (1) :118-120. 11Li GZ, Tao HL, Zhou C, et al.Midazolam prevents motor neuronal death from oxidative stress attack mediated by JNK-ERKpathwayJ.Hum Cell, 2021, 31 (1) :64-71. 12董育玮, 陆伦根.氧化应激在肝细胞癌中的研究进展J.胃肠病学, 2020, 18 (5) :304-306.
