太白银莲花皂苷B对人类胶质瘤细胞的生长影响,细胞生物学论文.docx

太白银莲花皂苷B对人类胶质瘤细胞的生长影响,细胞生物学论文神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤，其发病率占全部颅内肿瘤的40%，我们国家每年新查出此病患者为约为10万人。固然胶质瘤的发生率(3/105)比大多数其它肿瘤的发生率低,但由于它的无限增殖能力和侵袭性生长直接危及瘤体周围的很多重要的生命调节中枢以及对当前各种治疗不敏感,在肿瘤周围2cm以内的脑组织中均可能有肿瘤细胞生长，所以预后比任何其他系统的肿瘤要差得多，发病率高，预后差，尽管经过积极的外科手术治疗和化疗，华而不实位生存时间仍然不超过一年时间，给患者和患者家属及社会带来了沉重的医疗和精神负担，鉴于此，寻找新型抗肿瘤药物具有特别重要的深远意义。太白银莲花Anemonetaipaiensis为毛莨科，银莲花属，产自我们国家陕西秦岭，生长于海拔2900-3700米间山地草坡或多石砾处。太白银莲花皂苷B是文章中我们第一次研究了太白银莲花皂苷B对人类胶质瘤细胞的生长影响，探寻求索其对人胶质瘤细胞的生长抑制和促凋亡作用，为临床药物治疗恶性胶质瘤开拓了广阔的前景。1、材料与方式方法1.1细胞系和试剂人源性胶质瘤细胞系U87MG、U251MG、ECV304人脐静脉内皮细胞购买于美国ATCC公司，太白银莲花皂苷B分子式：C70H114O34，分子量：1498纯品由第四军医大学药剂科汤海峰教授提供。分子构造为3-O-D-xylopyranosyl-(13)-L-rhamnopyranosyl-(12)-D-glucopyranosyl-(14)-L-arabinopyranosyloleanolicacid28-O-L-rhamnopyra-nosyl-(14)-D-glucopyranosyl-(16)-D-glucopyranoside,高效液相色谱法(HPLC)分析其纯度大于95%图1。纯品溶解于DMSO,母液储存于-20冰箱，浓度为500g/mL，实验前取出稀释至工作浓度分装备用，分装液储存于-4冰箱，各实验组太白银莲花皂苷B工作液中含DMSO浓度均不超过1(v/v)以免影响皂苷B的生物学作用和胶质瘤细胞的活性。MTT购自Sigma公司，10%胎牛血清、DMSO溶剂、DMEM培养基和胰酶均购自GIBCO公司，PBS购自西安化学试剂厂，96孔板购自英国CORNING公司。1.2太白银莲花皂苷B对U87MG和U251MG细胞增殖的影响(MTT法)用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的U87MG和U251MG细胞，经0.25%胰酶消化后，经过细胞计数后，调整细胞密度为3104/mL，边震荡边种植于96孔板，每孔体积为200L，过夜贴壁，将太白银莲花皂苷B参加培养液中配制不同浓度的药物，使其终浓度为0.5，1，2，4，8，16，32，64mol/L,每个浓度有6个复孔，对照组为正常培养的细胞中参加MTT20L，37孵育4h，小心弃上清，参加150LDMSO，空白对照组没有细胞，其他的处理与药物组一样。在37、5%CO2培养箱培养72h后，每孔参加5mg/mL的MTT20L，37孵育4h后，小心吸弃孔内上清，每孔参加150LDMSO,震荡10min,使结晶充分溶解，在酶联免疫仪上选择490nm波长测定吸光度值(OD值)，计算6孔的平均值。以OD值间接计算出72h的IC25，IC50，IC75，抑制率=(对照组OD值-用药组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)100%。1.3荧光显微镜下观察经过Hoechst33342染色后细胞核的形态学变化取对数期生长状态良好的U87MG细胞，消化，离心，重悬，计数，调整细胞浓度至2104/mL，培养于24孔细胞培养板，200L/孔，置37、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。24小时后细胞生长贴壁，将细胞分为对照组，处理组，然后参加太白银莲花皂苷B工作液其终浓度为IC25，IC50，IC75，每个浓度有6个复孔，对照组细胞不作任何处理；置37、饱和湿度、5%CO2的培养箱中继续培养8h和24h，在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液的96孔板中，室温25以上，光学显微镜下观察，并采用照相系统进行照相和分析。接着向24孔板中参加3LHoechst33342，37、5%CO2培养箱中孵育10min，在荧光显微镜下检测细胞核。激发波长350nm，发射波长460nm，逐步进行后荧光显微镜下照相。2、结果2.1太白银莲花皂苷B对人胶质瘤细胞增殖和活性的影响不同浓度的太白银莲花皂苷B作用于U87MG和U251MG细胞后，观察72h的细胞生长抑制曲线，能够看出，太白银莲花皂苷B对胶质瘤细胞的生长抑制有剂量依靠性效应，能显著抑制细胞的生长，降低生存率。通过生长抑制曲线计算出太白银莲花皂苷B作用于U87MG细胞72h的IC25，IC50，IC75分别为5.2mol/L，6.7mol/L，8.7mol/L，U251MG的IC25，IC50，IC75为6.2mol/L，7.9mol/L，10.5mol/L。皂苷B对ECV304没有显著的生长抑制作用图2。2.2经Hoechst33342染色后，细胞形态学的变化典型的细胞凋亡形态学特征：细胞皱缩成圆球形，细胞核碎裂或者致密浓染，向核膜边缘聚集，染色质浓缩为半月状、车轮状或者马蹄状，凋亡小体出现。U87MG细胞经过药物处理后，Hoechst33342染色，在荧光显微镜下和光学显微镜下观察，正常细胞核荧光素染色较浅，细胞核较大，呈椭圆或者圆形，随着药物剂量和时间的变化，U87MG细胞逐步呈现出典型的凋亡形态学变化，这些特征在24h时更明显图3。3、讨论恶性胶质瘤，被归类到血管源性的肿瘤当中，它相比中枢神经系统的其他肿瘤，有更高层次的发病率，肿瘤中有丰富的血供，而且外侵性十分强。当前的治疗手段包括外科治疗，放射治疗，还有化学治疗，尽管在最佳治疗方案的积极治疗后，患者的预后仍然很差，平均生存时间不超过一年时间。众所周知，中国在治疗很多疾病方面有很好的疗效，据报道，从1940年到2006年的155种小分子抗肿瘤药物当中，有47%的药物是天然化合物或者从从它们中衍生而来。在肿瘤的研究领域中，利用中草药提纯出来的试剂来治疗肿瘤是一个新兴的研究领域。太白银莲花是秦岭的一种野生植物，生长于海拔2900-3700米间山地草坡或多石砾处。Xiao-YangWang等从太白银莲花中提取出了8个皂苷单体，对人类白血病细胞HL-60、肝癌细胞Hep-G2细胞有显著的细胞毒作用。太白银莲花皂苷B是初次从太白银莲花中提纯出来的皂苷单体，所以它的生物学效应当前仍然不太清楚，此研究表示清楚太白银莲花皂苷B对恶性胶质瘤U87MG和U251MG细胞有强烈的细胞毒效应，通过MTT实验能够看出，它对胶质瘤细胞具有剂量依靠性的生长抑制作用，其抗肿瘤作用可能有多种生物机制的介入，比方干预细胞周期进程和促进凋亡。药物处理后的细胞经过Hoechst33342染色后，荧光显微镜下观察，凋亡的细胞聚集成团块，细胞体积皱缩，从24孔板壁脱离，细胞核碎裂或者致密浓染，向核膜边缘聚集，染色质浓缩为半月状、车轮状或者马蹄状，凋亡小体出现。这些典型的凋亡特征在24h比8h更显著，能够看到Hoechst33342染色实验结果与光镜下的变化相一致。细胞凋亡Apoptosis又称程序性细胞死亡(programmedcelldeath，PCD)，牵涉一系列基因的激活、表示出以及调控，是由基因控制的细胞自主的有序性死亡方式。通过实验结果能够发现，太白银莲花皂苷B对人类恶性胶质瘤细胞U87MG和U251MG有强烈的剂量和时间依靠性的细胞毒效应，显著抑制了胶质瘤细胞的增殖，细胞核呈现出典型的细胞凋亡的形态学改变，其机制可能是通过活化凋亡途径而引起了细胞增殖的抑制。由于当前对其抗肿瘤作用研究还处于起步阶段，在动物及人的体内毒性实验、剂量控制及临床疗效都需要科学的评价，通过实验能够看出，太白银莲花皂苷B具有促进胶质瘤细胞凋亡的作用，说明其促凋亡的相关机制，可为为后续的动物实验和临床研究奠定基础，为临床治疗恶性胶质瘤开拓广阔的前景。