浅析恶性疟疾疫苗的研制,免疫学论文.docx
浅析恶性疟疾疫苗的研制,免疫学论文疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病，是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上约有 20 亿人口生活在疫区1.在我们国家，疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。 2018 年我们国家颁布了(中国消除疟疾行动计划2018 2020 年，提出在 2020 年全国实现消除疟疾的目的2.因而，对中国以及全球来讲，迫切需要研制预防疟疾的疫苗。 疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不特别清楚，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。 根据疟原虫在人体的生活史，可将疟疾疫苗分为 3 种，即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子孢子外表的环子孢子蛋白circumsporozoite protein,CSP是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame 等3研究发现，在 CSP 蛋白中存在重复 37 次的 Asn-Ala-Asn-ProNANP四肽重复序列NANP repeated motif，该序列重复 4 次，而且这种重复无株间差异。Gerloni 等4-5构建了包含3个重复的 NANP 四肽重复序列的 IgG 重链基因的重组质粒，并用该质粒免疫小鼠后，在持续 2 年的时间内观察到机体产生了特异的抗 NANP 反响。 Kubler-Kielb 等6通过蛋白质水平的偶联技术，实现了将 4 或 5 个重复的 NANP 四肽重复序列与pfs25蛋白质本身聚体的物理连接，并将此复合物免疫小鼠，结果显示，小鼠体内可产生特异性的抗 pfs25 蛋白及抗 CSP 应答。 基于 CSP 蛋白构造，美国葛兰素史克生物公司GSK研发了 RTS,S / AS01 恶性疟疾疫苗，2018 年的初步研究结果显示，在为期 12 个月的观察期内，6 000 名 5 17 月龄幼儿注射 3 剂疫苗后，患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了 56%和 47%7.这是恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。 NANP 四肽重复序列仅仅是 CSP 蛋白质的一个构造区域，若开发针对该四肽重复序列的单克隆抗体，则可提供检测该序列的特异性和敏感性，有益于基于 NANP 四肽重复序列的各项基础及应用研究。因而，本实验以 BSA-NANP5 偶联蛋白为免疫原，利用经典杂交瘤技术，挑选出 10 株杂交瘤细胞株，为进一步的研究工作奠定基础。 1 材料与方式方法 1. 1 多肽及细胞 NANP5 多肽、NANP5C 多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成，经HPLC 纯化后纯度为 95%,各合成 50 mg;SP2 / 0 骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。 1. 2 实验动物 SPF 级 BALB / c 鼠，雌性，6 8 周龄，体重 12 14 g,动物合格证号为：SYXK甘2020-0002；清洁级 F1 鼠，雌性，体重 16 g 以上，动物合格证号为：SYXK甘 2020-0003，均由本公司动物实验室提供。 1. 3 主要试剂 RPMI1640、胎牛血清、黄嘌呤hy-poxantin,HAT、氨基蝶呤aminopterin和胸腺嘧啶脱氧核苷thymidin培养基购自美国 GIBCO 公司；HRP、过碘酸钠NaIO4、HRP 标记的兔抗鼠 IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰肼adipicdihydrazide,ADH、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺1-Ethyl-3-3-DimethylaminopropylCarbodiimideHydrochloride,EDC购自美国 Sigma 公司；Imject Ma-leimide Activated BSA Kit 购自美国 Thermo Scienti-fic 公司；弗氏佐剂由本公司第四研究室制备；2-N-吗啉代乙磺酸2-N-Morpholinoethanesulfonic acidhydrat,MES、硫氰酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝 R-250 等为国产试剂。 1. 4 抗原板条 NANP5 及NANP5C 多肽、戊型肝炎病毒HEV、乙型肝炎病毒外表抗原HBsAg、睫状神经生长因子ciliary neurotrophic factor,CNTF等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存；CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠8,并由本公司第四研究室制备抗原板条。 1. 5 完全抗原的制备 选择 BSA 作为载体蛋白，应用下面 2 种方式方法将NANP5 或NANP5C 多肽与载体蛋白偶联。方式方法 1马来酰亚胺修饰的 BSA 与NANP5C偶联法：马来酰亚胺修饰的BSA与NANP5C 偶联，详细操作按 Imject Maleimide ActivatedBSA Kit 试剂盒讲明书进行：用 1 ml 的偶联缓冲液0. 083 mol / L sodium phosphate,0. 1 mol / L EDTA,0. 9 mol / L NaCl,0. 1 mol / L sorbitol,0. 02%叠氮钠，pH 7. 2配制马来酰亚胺修饰的 BSA,使载体蛋白终浓度为 10 mg / ml,取 0. 5 ml 用于偶联，同时用0. 5 ml 偶联缓冲液配制NANP5C 多肽 25 mg,终浓度为 50 mg / ml;将多肽与载体蛋白混匀，室温孵育 180 min;以 0. 083 mol / L PBS,pH 7. 2 作为透析缓冲液透析偶联产物，过夜。方式方法 2ADH-EDC介导的 BSA 与NANP5 偶联法:在 0. 5 ml BSA25 mg / ml中参加 0. 5 ml ADH以 0. 1 mol / LNaCl 为溶剂配制，浓度为 0. 25 mol / L，参加 0. 5 ml0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,参加 4. 5 mg EDC浓度为 0. 05 mol / L，室温反响 6 h,期间用 0. 05 mol / LHCl 调 pH 至 5. 6;以 0. 5 mol / L NaCl,pH 7. 2 作为透析缓冲液，透析偶联产物，过夜；取 0. 5 ml 透析产物，参加 0. 5 mlNANP5以 0. 2 mol / L MES 为溶剂配制，浓度为 10 mg / ml和 0. 5 ml 0. 2 mol / L MES,调 pH 至 5. 6,参加干粉 EDC浓度为 0. 05 mol / L室温反响 6 h,期间用 0. 05 mol / L HCl 调 pH 至 5. 6;以0. 01 mol / L PBS,pH 7. 4 作为透析缓冲液，透析偶联产物，过夜。偶联产物经 7. 5% SDS-PAGE 分析。
