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真菌毒素检测领域噬菌体展示技术的运用,分子生物学论文真菌毒素 mycotoxin 是由真菌产生的次级代谢产物，到当前为止已经发现超过 1000 多种真菌毒素，这些毒素仅由 350 多种真菌产生。真菌在陆地和海洋均广泛分布，在热带分布最广，因而污染也最重1.当前，全球关于真菌毒素污染的报道日益增加，且受污染的也不局限于大米、玉米、小麦、大麦等主要粮食作物，还有药用植物、水果、坚果、牛奶等。毒性较强的真菌毒素有玉米赤霉烯酮 zearalenone,ZEN 、伏马毒素 fumonisins,FB 、黄曲霉毒素 aflatoxins,AFT 、赭曲霉毒素 A ochratoxin A,OTA 、脱 氧 雪 腐 镰 刀 菌 烯 醇 deoxynivalenol,DON 、镰刀菌素 fusarin 、拟茎点霉毒素 phomopsins 、桔霉素 citrinin 等。不同的真菌毒素其致毒机制不同，表现为致癌毒性、细胞毒性、遗传毒性等多个方面。 由于真菌毒素对人类健康有宏大危害，因而国内外科研人员研发了多种检测真菌毒素的技术，主要有仪器确证法和利用免疫学原理挑选检测的方式方法。仪器法主要是高效液相色谱法2 HPLC 、质谱分析3 MS 、高效液相色谱-多级质谱法4等，这些方式方法显着的优势是能进行定性和定量分析且灵敏度高，但检测经过复杂、耗时、仪器设备特别昂贵、对实验室环境和实验员技能有严格的要求，进而限制了其用于大批量样品的挑选。利用免疫学原理进行大批量样品挑选检测的方式方法主要有酶联免疫吸附法5 ELISA 和免疫层析试纸法6,因其特异性高、灵敏度强、操作简单，甚至能够实现现场检测而发展迅猛。但上述方式方法均使生产人员和操作人员须长期接触真菌毒素标品，对其健康造成潜在危害，并存在二次污染的隐患。因而，近年来新兴的噬菌体随机肽库展示技术 phage display technology 引起很多学者关注，并以此技术研究毒素的替代品及抗体介入免疫化学反响，建立了相关的无毒检测免疫学体系。 1 噬菌体展示技术简介 SMITH7在 1985 年初次证实外源 DNA 能够插入丝状噬菌体基因中，并与 p蛋白融合展示，进而开创建立了噬菌体展示技术。由于这一技术具有库容量大，结合特异性强等特点，促使科研工作者对噬菌体展示技术进行了深切进入的探寻求索研究。 这些研究促进了无毒检测食品及饲料中真菌毒素体系的发展及昂贵真菌毒素抗体的替代。 1. 1 噬菌体展示系统的原理 噬菌体展示系统是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表示出，融合蛋白展示在病毒颗粒的外表，而编码这个融合子的 DNA 则位于该病毒粒子内。其原理是基于配体和受体反响的亲和选择性8,即利用展示在噬菌体外表的多肽或重组抗体 配体 与目的抗体 或 抗 原 受 体 的 亲 和 能 力 进 行 淘 选 panning ,淘选到与受体具有高亲和性的、空间构象与目的配体构造类似的模拟表位，进而可用这模拟表位取代相应的有毒抗原或不易获得的抗体。常用丝状噬菌体病毒包括 f1、fd 和 M13 三类，其基因组编码 11 种蛋白质，华而不实 5 种为构造蛋白，与噬菌体展示密切相关的是两种不同的构造蛋白 p和 p。p蛋白的 N 端 1-5 氨基酸残基区域 为可活动的、外露在噬菌体外表的肽段，是插入外源基因的最佳位置； p蛋白最外露的是穿膜区 N 端 ,因此亦是插入外源基因的理想位置，构成的融合蛋白表示出在噬菌体颗粒的外表，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时也保持了外源基因蛋白的天然构象，并可被相应的受体所辨别。利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗方式方法，洗去非特异结合的噬菌体，挑选出目的噬菌体，使得各种靶分子 抗体、酶、细胞外表受体等 的多肽通过体外选择程序得以快速鉴定。而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链 DNA 测序推导出来。 该技术实现了基因型和表型的转换。 1. 2 噬菌体展示系统的分类 噬菌体展示系统分为： 丝状噬菌体展示系统、T7 噬菌体展示系统、T4 噬菌体与 噬菌体展示系统； 其所展示内容包括随机肽段、天然肽段、cDNA、抗体、抗体片段等。根据展示内容所建立的文库又可分为随机肽库、抗体库、cDNA 文库等，华而不实用于挑选真菌毒素的模拟表位和不易获得抗体的常用文库分别是随机肽库和抗体库。 1. 2. 1 噬菌体随机肽库 随机肽库是将编码外源肽的 DNA 短序列插入到噬菌体编码外壳蛋白的基因组中，使各种组合的随机肽段与噬菌体外壳蛋白融合表示出于噬菌体颗粒外表，被展示的肽可保持相对独立的空间构象和生物活性。而这特定的空间构象和生物活性能模拟小分子抗原，因而随机肽库经过 3 4 轮的挑选就能获得小分子的模拟表位。用于淘选的噬菌体展示肽库是基于完全随机的肽库序列，当前商业肽库主要有 7 肽库 Ph. D. -7 、12 肽库 Ph. D. -12 与环 7 肽库 Ph. D. -c7c 等。随着研究的深切进入，为了获得亲和性更好的模拟表位，相关研究人员分析比拟从随机肽库淘选到的阳性克隆噬菌体的氨基酸序列，获得其共有氨基酸序列，然后在共有序列两侧分布随机氨基酸残基构建二级肽库9-10.从概率论和竞争关系的角度分析，二级肽库比随机肽库更易挑选到理想的模拟表位11-12,是解决当前采用噬菌体文库挑选到的模拟表位与抗体的亲和性较低这个瓶颈的一个突破口。 1. 2. 2 噬菌体抗体库 传统的免疫检测抗原的抗体为多克隆抗体和单克隆抗体两种。多克隆抗体比拟易于快速生产，但是它并不合适小分子检测，非特异性反响也较多； 而基于杂交瘤技术生产的单克隆抗体有很高的专一性，但单克隆抗体的生产费时、应用昂贵，且伤害动物。而基于噬菌体1抗体的优势又克制了其缺点13,且为制备小分子抗体提供了有效手段。该技术能够将抗体功能片段有效地展示于噬菌体外表，利用靶抗原对噬菌体抗体库进行亲和挑选，进而获得针对该抗原的重组噬菌体抗体。 当前噬菌体展示技术可展示单链抗体 singlechain variant fragment,scFv 及基于克隆重链抗体可变区构建的只由一个重链可变区组成的单域抗体 variable domain of heavy chin of heavy-chainantibody,VHH 等。scFv 编码基来由重链可变区基因和轻链可变区基因通过人工合成一条寡核苷酸序列 linker 相连融合表示出在噬菌体载体的外表14.重链抗体发现于羊驼、骆驼及护士鲨等动物体内，与普通抗体相比缺少了轻链，只保存了对抗原的结合能力的可变区； 基于其构建的 VHH保存了重链抗体的分子量小、物理稳定性高、易表示出等 特 点，且 亲 和 力 高、不 易 聚 集 而 被 广 泛应用15. 2 噬菌体展示技术在真菌毒素检测领域的研究与应用 噬菌体展示技术的不断发展，为真菌毒素检测领域的延伸和扩展带来新的方向。噬菌体展示技术主要应用于挑选真菌毒素的模拟表位和抗真菌毒素的重组抗体。 2. 1 噬菌体模拟表位肽在真菌毒素检测的研究与应用 最近几年科研人员淘选各种真菌毒素模拟表位的工作情况见表 1.获得的模拟表位可用于ELISA、试纸条、快速试纸法和胶体金快速斑点结合免疫分析等方式方法检测真菌毒素。YUAN 等16淘选出 2 个较理想的模拟表位，合成了华而不实的一条模拟序列 SWGPFPF,用于检测小麦中 DON,其线性范围为 100 10 g/ml; 同时，将合成多肽做了细胞毒理实验，结果表示清楚对细胞没有明显的毒害，因而可利用模拟表位肽建立无毒免疫学检测体系。HE 等17-18将在 2018 年用 7 肽库挑选到的 1 个模拟表位与在 2020 年用 12 肽库淘选到的一个模拟表位进行了比拟分析，发如今胶体金快速斑点结合免疫分析检测 ZEN 的临界值都是 50ng /ml,表示清楚噬菌体展示肽的长度可能对小分子模拟表位的亲和性影响较小，决定性因素还是展示肽的序列及其构象。黄思敏等19 分别用 12 肽库和 7 肽库淘选桔霉素的模拟表位，最低检测限 LOD 均为 10 ng/ml,进一步证明模拟表位亲和性的决定性因素主要是展示肽的序列及其构象，与其长短关系不大。WANG 等20对其实验室生产的单抗所淘选的 AFB1模拟表位与邓省亮等21使用中国协和医科大学的单抗所筛出的模拟表位进行了比拟，结果显示前者的最低检测限和线性范围比后者提高了 40 倍。除了抗体本身的因素外，前者是使用 10% 甲醇进行竞争性洗脱淘选AFB1模拟表位，而后者使用酸洗脱淘选，表示清楚洗脱试剂对能否淘选到理想的模拟表位也是一个关键影响因素。LIU 等22筛出伏马毒素 B1的模拟表位，将合成模拟表位的 7 个氨基酸偶联至 BSA并建立了 ELISA 方式方法检测伏马毒素 B1,结果显示无穿插反响，与商品化 ELISA 试剂盒和 HPLC 检测结果一致，表示清楚模拟表位肽完全能够取代毒素标准品。YU 等23 获得了一个拟茎点霉毒素模拟表位并建立了相应的 ELISA 方式方法，与传统的ELISA 检测方式方法相比检测灵敏度提高了 100 倍。 同时，近年文献报道显示环肽库比非环肽库淘选出来的模拟表位半抑制率 IC50 更低，分析其原因可能是成环的氨基酸序列更能模拟抗原的表位24.2020 年，HE 等26构建二级肽库获得了 OTA的理想模拟表位。该课题组利用商业 12 肽库和环 7 肽库淘选获得阳性克隆噬菌体，分析了这些噬菌体的氨基酸序列，得出共有序列 FQLH,固定共有序列并在其两侧分布其他任意氨基酸残基构建了二级 12 肽库； 用这二级 12 肽库淘选出来的模拟表位建立 ELISA 方式方法检测 OTA,结果显示检测 OTA 的 LOD 到达 6 pg/ml,其检测灵敏度与用商业肽库直接淘选的模拟表位建立的 ELISA 方式方法的 LOD 150 pg/ml 相比极大提高。这些数据表示清楚了二级肽库的优越性，因而在随机肽库的基础上构建二级肽库为今后获得检测灵敏度更高层次的真菌毒素模拟表位开拓了一条新途径。 以上研究显示，采用噬菌体展示技术淘选的真菌毒素模拟表位完全能够成为真菌毒素的替代品，用其建立的免疫学检测方式方法检测灵敏度可能更高层次且对生产和操作人员的伤害可降到最低。【1】 2. 2 噬菌体抗体库在真菌毒素检测的研究与应用 最近几年利用噬菌体抗体库挑选的抗真菌毒素重组抗体并用其检测相应的真菌毒素的 IC50研究结果见表 2.YUAN 等27获得了抗 ZEN 的 scFv,用 scFv 建立了 ELISA 检测 ZEN,结果显示与单克隆抗体建立的 ELISA 方式方法检测结果一致，但 scFv与 ZEN 的类似物有更高层次的穿插反响，且不耐受甲醇溶液。ZOU 等28淘出的 scFv 与单克隆抗体相比在检测伏马毒素 B1的 IC50接近，无穿插反响，与 HPLC 对伏马毒素 B1的回收率实验结果类似，合适快速、大量、低成本的检测伏马毒素 B1.YANG 等29筛到了抗 AFB1的 scFv,表现为与AFB1类似物穿插反响低，优于传统的 ELISA 检测方式方法； 但与 WANG 等30淘选到 AFB1的 VHH相比，VHH 的 IC50更低且能耐受 20% 的甲醇，唯一缺乏的是与 AFB1类似物穿插反响率较高； 分析其原因可能与 VHH 缺少轻链更易与小分子抗原结合有关。HOUWELINGEN 等31筛到了一株与 OTA 类似物无明显的穿插反响、亦能耐受甲醇的 VHH.VHH 重组抗体比 ScFv 重组抗体在检测真菌毒素时具有更高层次的灵敏度和稳定性，究其原因可能是 VHH 重组抗体仅具有 3 个而不是 6 个互 补 性 决 定 区 环 complementaritydeterminingregion loop,CDR loop 构象。重组抗体具有单克隆抗体类似的检测灵敏度，且拥有单克隆抗体不具备的价格低、易生产的优势，因而利用噬菌体展示技术挑选的重组抗体建立相应的检测方式方法来检测真菌毒素能够大大降低成本，为更全面地检测食物链中的各个环节的污染提供了可能。【2】 3 结束语 真菌毒素对人类健康危害很大，所以加强检测食物链中的真菌毒素的污染是当务之急。然而，当前所报道的真菌毒素的检测成本高昂、同时对检测人员及生产人员都存在潜在的危害。噬菌体展示技术的出现及其在真菌毒素检测中应用，使得成本低廉且无毒的检测体系成为当今真菌毒素检测的新手段。但此方式方法牵涉到展示的多肽在体外需要实现正确的折叠才能模拟真菌毒素，因而在实际应用中并不能完全替代真菌毒素标品且存在与抗体亲和力相对弱的情况。针对上述缺陷，当前已有科研工作者利用计算机软件进行抗体与模拟表位的分子对接分析，通过对模拟肽中的氨基酸残基进行替换来提高抗体与模拟肽的亲和力及提高肽的稳定性。相信科研工作者对噬菌体展示技术库的构建和淘选方式方法的不断探寻求索及多学科的穿插，必然会克制缺乏，使利用无毒检测真菌毒素体系的检测方式方法灵敏度更高层次，特异性更好，成本进一步降低。