甲醛脱氢酶的纯化,生物工程论文.docx

甲醛脱氢酶的纯化,生物工程论文摘 要 甲醛是一种极具代表性的室内有机污染物，对人体危害极大。甲醛治理措施包括物理措施、化学措施及生物措施。生物措施因安全有效，不会带来再次污染，对长期延迟缓慢释放的甲醛有良好的治理效果等好处，在甲醛治理中存在明显优势。细菌是净化甲醛的主要微生物，对长期延迟缓慢释放的甲醛有良好的治理效果，并且生物手段具有高经济效益、无污染、操作简便等优点，但从霉菌中检测到FADH活性的报道较少。本课题选用经诱变处理后的甲醛抗性菌株-宛氏拟青霉菌，对其进行液体培养，进而得到菌体，依次通过超声波细胞破碎、硫酸铵沉淀、透析及柱层析，纯化得到活性高的FADH。本实验的重点是通过DEAE-Sepharose、Sephadex-G100、CM-Sepharose三个柱层析条件的探寻求索，提高酶活力，便于 后期制成 商品化 产 品投入市场 ，带 来良 好的 经济和 社会 效益。 结 果 表 明 ： DEAE-Sepharose层析上样量为64 m L、洗脱流速为1.5 m L/min，Sephadex-G100凝胶过滤层析上样量为5%CV、洗脱流速为0.50 m L/min，CM-Sepharose上样量为3%CV、洗脱流速为0.75 m L/min时，对甲醛脱氢酶的分离纯化效果最佳。 本文关键词语 ： 宛氏拟青霉菌 甲醛脱氢酶 蛋白质纯化仪 层析柱条件优化 酶活力测定。 Abstract Formaldehyde is a representative indoor organic pollutant, which is harmful to human body. At present, three methods are uesed for Formaldehyde treatment. They are the physical method,the chemical method and the biological method, respectively. Because of its safety and efficiency,biological method can not produce secondary pollution, and has good control effect onformaldehyde released slowly for a long time, so it has obvious advantages in formaldehydetreatment.Bacteria are the main microorganisms for the purification of formaldehyde, which hasgood control effect on formaldehyde released slowly for a long time, and has the adavantage ofhigh economic benefit, no pollution and simple operation. However, there are few reports on thedetection of FADH activity from mold.In this study, the formaldehyde-resistant strainPenicillium Wan, which was treated by mutagenesis, was cultured in liquid, and the bacteriawere purified by ultrasonic cell fragmentation, ammonium sulfate precipitation, dialysis andcolumn chromatography to obtain the highly active FADH.The key point of this experiment is toimprove the enzyme activity by exploring the three column chromatography conditions ofDEAE-sepharose Sephadex-G100 CM-sepharose, so as to make the commercial products intothe market in the later stage, and bring about good economic and social benefits. The resultsshowed that the amount of sample was 64 m L in the fraction DEAE-Sepharose chromatography,the flow rate of elution was 1.0 m L / min, the amount of sample in Sephadex-G100 gel filtration chromatography was 5%CV, the elution rate was 0.50 m L / min CM-Sepharose was 3%CV, andthe elution flow rate was 0.75 m L/min, the best separation and purification effect offormaldehyde dehydrogenase was obtained. Key words : Paecilomyces variotii;formaldehyde dehydrogenase;Protein purifier;Chromatography purification condition optimization;Enzyme activity determination。 1、引言 1.1、甲醛简介。 1.1.1、甲醛的来源。 甲醛是一种极具代表性的室内有机污染物，长期存在于室内空间，是室内空气污染中主要污染物之一。室内甲醛的主要来源有两个方面，包括室内污染和室外污染。室外的甲醛污染气体在特定情况下能够进入室内，导致室内空气中含有较高的甲醛含量。室内甲醛则主要来源日化品和室内装修材料。华而不实，室内装修材料是当前室内甲醛污染的首要来源1。 1.1.2、甲醛的危害。 甲醛是一种原生物质，可经过吸入及皮肤接触对人体健康造成危害，它对人体的毒害牵涉多系统、多器官。它对人的呼吸系统、免疫系统、肝脏、皮肤、内分泌系统都会产生危害。严重的还会产生胚胎毒性，引起胚胎畸形。甲醛还具有致癌作用，早在2004年国际癌症权威机构已将甲醛定义为文章为本科论文，如需全文请点击底部下载全文链接】 2、材料与方式方法 2.1、实验材料 2.1.1、 菌种 2.1.2、培养基 2.2、主要试剂与溶液配制. 2.2.1、主要试剂 2.2.2 、溶液储存 2.3 、主要仪器与设备 2.4、实验方式方法 2.4.1、F1-23 的活化 2.4.2、F1-23 的液体培养 2.4.3、考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 2.4.4、FADH的粗提取 2.4.5、FADH酶活的测定方式方法 2.4.6、硫酸铵沉淀 2.4.7、透析 2.4.8、DEAE-Sepharose层析条件的探寻求索 2.4.9、Sephadex-G100凝胶过滤层析条件的探寻求索 2.4.10、CM-Sepharose层析条件的探寻求索 2.4.11、SDS-PAGE电泳 3、结果与分析 3.1、蛋白质标准曲线的绘制 3.2、DE AE - SepharoseAKTA层析图谱 3.3、Sephadex-G100洗脱曲线 3.4、CM-Sepharose洗脱曲线 3.5、SDS-PAGE电泳 3.6、SFADH的纯化效果. 4、结论与瞻望 随着生活水平和科学技术的发展，人们越来越关注本身的健康问题，对室内甲醛含量的关注也日益增加。室内甲醛对人类的健康威胁较大，而且很难避免。因而，甲醛降解方面的研究是一个热门课题，具有宏大的发展潜力，也会带来宏大的经济效益和社会效益。 实验的最终结果是通过一系列的生化分离得到了纯度较高的甲醛脱氢酶酶液。当DEAE-Sepharose层析上样量为64 m L、洗脱流速为1.5 m L/min，Sephadex-G100凝胶过滤层析上样量为 5%CV、洗脱流速为0.50 m L/min，CM-Sepharose上样量为3%CV、洗脱流速为0.75 m L/min时，对甲醛脱氢酶的分离纯化效果最佳。但是实验主要是通过对三步柱层析条件进行优化来纯化甲醛脱氢酶，操作相对复杂、耗时久而且纯化的花费较高，故在实际生产中有一定的局限性。因而，能够考虑直接采用三级色谱柱连用，或者利用亲和层析纯化。可以以先测出甲醛脱氢酶的等电点，直接采用两步柱层析纯化酶液。 甲醛脱氢酶的特异性和灵敏性很高，便于检测和治理甲醛。但是甲醛脱氢酶对环境要求高，温度、湿度、酸碱度都会影响它的活性；其次这类物质的稳定性差，易分解，所以无法保证长期的除甲醛效果；最后这类方式方法的安全性尚待验证，由于该类技术仍处在研究阶段。本实验尚未对甲醛脱氢酶进行固定，故还无法直接应用于家庭，也不能直接降解空气中的甲醛。甲醛脱氢酶的固定化方式方法的研究是至关重要的，假如该方面获得较大进展，对于家庭的甲醛治理将会特别有益。 以下为参考文献 1 罗洪镁室内甲醛污染来源、危害及防治技术研究进展节能环保, 2021:288. 2 孙兆东甲醛的危害及防治方式方法简述科技风。2020(14):194-200. 3 杨华萍.室内甲醛检测方式方法及防治措施研究进展研究与开发, 2021, 43(10)124. 4 白丽丽室内甲醛污染及防治措施的研究资源节约与环保，2021, (04) :60-63. 5景荣荣.7种室内耐阴观叶植物对甲醛污染的耐胁迫能力及净化能力研究D.山东建筑大学,2021:1 -2. 6 胡秀芳，谢梦梦,邵雪莲.微生物对甲醛的净化效应与作用机制生物资源, 2021, 39(04);257-258. 7姚璐晔,李欣怡，史琦琳,等.宛氏拟青霉菌甲醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质J.生物技术,201 6, 26(06):587-592. 8张婧甲醛分解途径关键酶的原核表示出与纯化及应用研究D昆明理工大学, 2018:7-8. 9 张婧，年洪娟,陈丽梅微生物甲醛脱氢酶研究进展生物技术通报, 2018, 03:50-57. 10 Mitsui R, Omari M Kitazawa H, et al . 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