鼠疫实验室检验中检测方法与检测试剂的相关问题,职称论文.docx

鼠疫实验室检验中检测方法与检测试剂的相关问题,职称论文内容摘要：2022年11月，北京市经实验室检验确诊2例鼠疫病例，根据患者的流行病学史与临床表现确以为输入性肺鼠疫，这是建国后肺鼠疫初次输入北京市。该起疫情中实验室检测发挥了重要作用，本文简单介绍此次疫情中的实验室检测经过并重点讨论鼠疫实验室检验中检测方式方法与检测试剂的相关问题。本文关键词语：鼠疫; 实验室检验; 北京;Discussion on plague laboratory examinationLU Yan-ning LI Fu SUN Yu-lan ZHANG Dai-tao LI Ren-qing DOU Xiang-feng PANG Xing-huo WANG Quan-yi CHEN Li-juanBeijing Center for Disease Control and Prevention/Beijing Center for Preventive Medicine ResearchAbstract：In November,2022,two imported pneumonic plague cases were confirmed by laboratory testing together with the epidemiology history and clinical manifestation of the patients,which is the first time that pneumonic plague has been imported into Beijing since the founding of the People s Republic of China.Laboratory verification played an important role in fighting the outbreaking of imported pneumonic plague.In this paper,the laboratory testing process was introduced briefly,and the problems relating to laboratory examination of plague was then discussed,focusing specially on the problems in the detection method and reagents.2022年11月12日，北京市经实验室检验确诊2例鼠疫病例，根据患者流行病学史与临床表现确以为输入性肺鼠疫病例。这是新中国成立70年来，鼠疫病例初次进入北京市。鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性疾病，因其传染性强、传播速度快、病死率高，而被列为法定甲类传染病之首。早期发现人间鼠疫的感染，需要快速、敏感、特异、准确的实验室检测方式方法，这对鼠疫疫情的防控极为重要。在北京市本起输入性疫情处置中，北京市疾病预防控制中心(CDC)实验室根据现行鼠疫诊断标准中的方式方法对相关样本进行了检验，在四个小时内完成了病例样本的实验室检测工作，为疫情处置提供了确实有效的根据。但检测中暴露出的一些问题仍值得进一步讨论。1 病例及样本信息2 例病例为夫妻关系，男性病例43岁，女性病例46岁，均为牧民。男性病例10月25日在内蒙古发病，女性病例在护理男性病例后于10月31日发病。首发异常感觉和状态均为发热、咳嗽、咳痰、痰中带血丝，胸闷、憋气、全身乏力、肌肉酸痛，体温最高39.5，伴寒战，病情均急剧恶化，治疗中均使用了抗生素。2例病例在11月3日乘坐同一辆救护车由内蒙古到首都医科大学附属北京朝阳医院就诊。11月11日采集两位病例的非抗凝全血、EDTA抗凝全血及痰样本，送至北京市CDC实验室进行检测。2 检测根据及实验方式方法2.1 检测根据以(鼠疫诊断标准WS 279-2008附录B、C、D、E、F为检测根据。2.2 实验方式方法2.2.1 鼠疫F1抗原检测:采用胶体金法鼠疫菌抗原检测试剂(胶体金法)，北京金豪制药股份有限公司、反相血凝试验鼠疫菌F1抗原诊断试剂盒(反相血凝法)，兰州生物制品研究所有限责任公司以及ELISA法鼠疫耶尔森菌F1抗原检测试剂盒(酶联免疫法)，兰州生物制品研究所有限责任公司进行鼠疫菌F1抗原的检测。详细方式方法参照试剂盒讲明书进行。2.2.2 鼠疫F1抗体检测:采用胶体金法鼠疫抗体检测试剂(胶体金法)，北京金豪制药股份有限公司、间接血凝试验鼠疫菌F1抗体诊断试剂盒(间接血凝法)，兰州生物制品研究所有限责任公司以及ELISA法鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂盒(酶联免疫法)，兰州生物制品研究所有限责任公司进行鼠疫F1抗体的检测。详细方式方法参照试剂盒讲明书进行。2.2.3鼠疫菌特异性核酸检测:采用三种商品化鼠疫杆菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法，中山大学达安基因股份有限公司，深圳生科原生物股份有限公司，江苏硕世生物科技股份有限公司)以荧光PCR法检测鼠疫菌的特异性基因。详细方式方法参照试剂盒讲明书进行。2.2.4 鼠疫菌分离培养:以哥伦比亚血平板(英国OXOID公司，货号PB0123A)对痰及抗凝血进行划线培养。同时将抗凝血接种需氧双向血培养瓶(郑州安图生物工程股份有限公司)进行培养。3 实验室检验3.1 样本采集此次疫情中，病例样本采集了痰、抗凝血与非抗凝血。华而不实对痰和抗凝血提取了核酸并进行基因检测;非抗凝血分离了血清，进行抗原和抗体检测。同时抗凝血分离了少量血浆进行了抗原检测。3.2 检验程序实验室接到样本后，首先进行样本的前处理，非抗凝血离心分离血清，抗凝血和痰样本进行核酸提取。血清分离后，首先在生物安全柜内进行抗原、抗体的胶体金法检测，然后取适量样本56、30 min灭活，以备后续用于血凝试验及ELISA试验。将痰与抗凝血划线接种于哥伦比亚血平板进行细菌分离培养，同时将抗凝血接种于血培养瓶进行培养。核酸提取后，配制反响体系，加样，上机反响。然后进行反相血凝试验和间接血凝试验进行抗原、抗体检测。在反相血凝试验和间接血凝试验的孵育时间内采用ELISA法进行抗原、抗体的检测。鼠疫疫情的实验室检测要求快速与准确，此检验流程使时间利用效益最大化，能够在最短时间内获得检测结果。由于鼠疫的检测项目与检测方式方法较多，时间与人员布置要合理以保证在最短时间内获得可靠的检测结果。3.3 检测结果男性病例痰样本的核酸检测阳性，血浆鼠疫抗原胶体金检测阳性，血清鼠疫F1抗原反相血凝法检测阳性，血清鼠疫F1抗体三种方式方法检测均阳性。女性病例血清鼠疫F1抗体三种方式方法检测均阳性。其余检测项目均为阴性。3.4 生物安全防护在中国卫生部2006年制定的(人间传染的病原微生物名录中，鼠疫菌是危害程度分类为第二类的病原微生物，属高致病性病原微生物，根据该文件的规定，该类样本的检测能够在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行，大量活菌操作和动物感染实验要在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行。此次疫情中，所有的实验操作均在负压生物安全二级实验室内进行。人员防护采用连体式防护服，同时佩戴帽子、N95口罩、防护眼镜及双层手套。4 鼠疫实验室检验中存在的问题4.1 样本采集实验结果提示痰样本核酸检测效果优于血样本，因而对怀疑肺鼠疫的病例除了采集血液样本外，一定要采集呼吸道样本，如痰或下呼吸道样本。以血浆进行胶体金法抗原检测结果优于血清，因而血浆可作为胶体金法抗原检测的一个备选样本。对于疑似鼠疫的病例，应尽早并尽量将所有能采集到的样本及时采集并保存。由于鼠疫菌对当前常用的抗生素均敏感1,2，应用抗生素后，较难培养出鼠疫菌，因而一定要在抗生素使用之前采集样本做细菌的分离培养。4.2 检测方式方法鼠疫检验包括细菌学、血清学和分子生物学三个方面。鼠疫固然是传染病防控中极为重要的一个疾病，被列为法定甲类传染病之首，但鼠疫的实验室检验一直沿用一些老方式方法，鼠疫的诊断也一直采用经典的 四步检验 与血清学方式方法。4.2.1 细菌学检测:作为鼠疫确诊的金标准，在鼠疫检测中发挥主导作用3。 四步检验 法包括显微镜涂片检查、分离培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物实验，耗时长，敏感性差，而且由于抗生素的早期广泛使用，鼠疫菌在临床样本中的分离率越来越低，仅依靠病原分离来确诊鼠疫是不够的，也不合适人间突发疫情的应急检测。4.2.2 血清学检测:抗原、抗体检测采用了胶体金法、血凝试验和ELISA法进行。采用三种方式方法进行检测，检测结果能够互相印证与补充，保证结果的准确性。假如依靠F1抗体检测结果来做确诊，需要拿到急性期和恢复期双份血清，因而此法仅适用于回首性诊断，而不适用于突发疫情的应急处置。另有研究发现部分正常人群中可检测出高滴度的F1抗体4，因而其特异性也值得讨论。而F1抗原检测，由于抗生素的使用，患者体内鼠疫菌增殖受限，菌量少，样本中F1抗原的含量也低，无论是使用胶体金法、血凝试验还是ELISA法检测，都存在一些问题。鼠疫血清学检测固然具有简单、快速、试剂易标准化、可现场操作等优点，但由于试剂质量、操作者经历体验等原因会导致假阳性或假阴性结果的出现。此次疫情处置中，在首发病例报告后启动的后续病例筛查检测中，胶体金抗原检测出现假阳性结果，而ELISA法检测F1抗原的敏感性不高，反相血凝试验的敏感性固然略高于ELISA法，但操作复杂，最好由有经历体验的人员进行，且耗时长，结果判定也受主观因素影响。4.2.3 分子生物学检测:具有快速、敏感、特异等优点，对于鼠疫的诊断具有重要作用5，进而越来越多地应用在鼠疫的应急检测中，但对样本的采集部位及样本质量依靠性高。此次疫情中，由于抗生素的使用抑制了鼠疫菌的增殖，因而女性病例的样本中未检测到鼠疫菌F1抗原，也未检测到鼠疫菌的核酸，最终也未分离到鼠疫菌，由此可见分子生物学的检测结果与其他方式方法的病原学检测结果是一致的。此次疫情中核酸检测未采用标准中的普通PCR法，而是采用了实时荧光PCR法，不仅能够提高检测的灵敏性，还可大大缩短检测时间。同时采用三个不同品牌的商品化试剂盒，以Taqman探针法的实时荧光PCR检测鼠疫菌的不同基因位点，包括helix-turn-helix domaincontaining protein、caf1和pla基因，可提高检测的特异性和敏感性，检测结果互相印证，保证结果的准确性。另外，高通量测序技术越来越多地用于感染性疾病的病原筛查，并且经常能获得重要线索6,7。因而，在当下新技术不断涌现的情况下，针对鼠疫这个古老的疾病也需要投入经费和精神研发一些更好的检测方式方法和检测试剂，以应对各种突发疫情的不同状况。而鼠疫的诊断标准也需要与时俱进做一些修改，除了关注细菌学、血清学的指标和方式方法外，应引入一些分子生物学方式方法和指标，比方将高通量测序的方式方法和结果纳入鼠疫确诊根据。4.3 试剂储备鼠疫是重要传染病，但也是少发病，鼠疫各种检测试剂的效期并不长，日常实验室中少量的试剂储备和更新是必需的。一旦有疫情发生，试剂的需求量将大大增加，因而检测试剂的储备方案也是一个值得讨论的问题。储备哪些试剂，储备多少量，储备在哪个层级，都是值得商榷的问题，并应有施行方案和应急措施。4.4 技术储备在新的时代，各种治疗手段的早期干涉，十分是抗生素的使用，使鼠疫在流行病学方面或在临床医学和检验医学方面都展现出新的特征。有必要利用当代前沿的技术手段愈加迅速地辨别与控制疾病的流行，因而应紧跟检验技术发展的步伐，建立愈加前沿的技术储备，包括分子生物学技术方面，如高通量测序技术、各种高通量多病原筛查技术、飞行时间质谱技术以及免疫学方面的检测技术，如上转发光、免疫荧光、酶联免疫等抗原抗体检测技术，以应对各种形式的突发疫情。4.5 人员储备对于鼠疫这类重点传染病，固然是少发病，但是保证必要的技术人员储备是必需的。要有熟练把握鼠疫相关检测技术的实验室工作人员，并能保证定期参加专业培训以维持其技术能力和知识更新，并能作为师资气力在突发疫情发生时可应急培训相关人员以加强检验队伍的气力，为疫情处置提供坚实的后盾。4.6 实验室条件鼠疫菌为高致病性病原微生物，固然基本的临床样本的检测工作能够在BSL-2实验室内进行，但根据相关法律法规的规定，一些愈加深切进入的工作(如一些难培养的样本要进行动物接种分离培养)则需要在生物安全级别更高层次的实验室条件下进行。因而高级别的生物安全实验室对鼠疫检测工作的顺利开展是愈加完备的配置。鼠疫迄今仍严重威胁人类的生命与健康，鼠疫的预防与控制仍然是公共卫生领域的重要任务。实验室检验是发现和证实鼠疫的重要手段，也是防制和治疗鼠疫的主要根据。检测的准确性与及时性，具体表现出着鼠疫防治工作的总体水平和成效。因而，在鼠疫突发疫情的应急检测中应优化检验流程，综合判定各种检测结果，进而快速准确地做出疫情研判，启动后续的防控工作，持续改良鼠疫的实验室检测方式方法，提高检验检测的水平。以下为参考文献1BUTLER T.Plague gives surprises in the first decade of the 21st century in the United States and worldwideJ.Am J Trop Med Hyg,2020,89(4):788-7932BUTLER,THOMAS.Plague into the 21st centuryJ.Clin Infect Dis,2018,49(5):736-7423王艳华，海荣，夏连续，等4种鼠疫F1抗原/抗体检测方式方法的初步评价J中国媒介生物学及控制杂志，2018,21(1):39-424王鹏，张建中鼠疫免疫学检测的研究进展J中国人兽共患病学报，2018,25(10):996-9995杨晓燕，杜国义，刘合智，等河北省一起鼠疫疫情的实验室断定J中华卫生杀虫药械，2022,25(2):141-1436王红燕，白冰，李萌，等2例坏死性肺炎的病原学分析J国际病毒学杂志，2022,26(5):327-3307潘欢弘，魏雄杰，宗俊，等一起人7型腺病毒引起的幼儿园聚集性疫情调查J国际病毒学杂志，2021,25(1):43-47.