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细胞氧化还原平衡调控与衰老的最新研究进展,生物化学论文衰老现象在自然界中广泛存在，它是一种内源的逐步发生的并会对发生个体产生持续性损害的经过在关于衰老发生的理论假讲中，衰老的自由基假讲(the free radical theory of aging)自 20 世纪 50年代提出伊始，便遭到广泛关注，与端粒酶假讲、细胞分裂极限假讲等成为推动衰老基础研究的重要假讲之一该假讲以为太多的氧化复原活性自由基能够造成生物大分子的氧化损伤，导致衰老研究发现，伴随衰老的发生发展，线粒体产生的过氧化氢增加，机体氧化损伤增加，而过表示出抗氧化酶的转基因果蝇寿命延长，这些结果都支持了衰老的自由基假讲在近期发表的关于衰老标志的综述中，作者列举了基因组不稳定、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白质稳态异常、营养感受异常、线粒体功能紊乱、细胞衰老、干细胞耗竭、细胞通讯障碍九个方面的衰老标志，华而不实基因组不稳定及线粒体功能紊乱与活性氧有直接关系，其他方面也存在间接调控因而，细胞的氧化复原调控是衰老研究中的重要问题，衰老经过中氧化复原调控机制的研究对揭示衰老机制和延缓衰老及健康衰老具有重要意义1、细胞氧化复原平衡调控与衰老细胞内有一套完好的氧化系统和复原系统，氧化系统主要包括活性氧 / 活性氮 (ROS/RNS：reactive oxygen/nitrogen species)两大 家族 ， 华而不实活性氧 (ROS)包括 O2 ，HO ，HO2 ，H2O2，1O2,RO ，ROO (R 表示烷基)等，活性氮(RNS)包括NO，ONOO-，NO+，N2O3等主要产生自线粒体、过氧化物酶体、NADPH 氧化酶、 细胞色素 P450、黄嘌呤氧化复原酶系统等，外源主要与紫外线、电离辐射、环境毒素等有关而复原系统主要包括大分子抗氧化酶类(如：超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等)和小分子抗氧化剂(如：谷胱甘肽、维生素 C、维生素 E 等)硫氧还蛋白系统和谷氧还蛋白系统是重要的內源抗氧化系统二硫键异构酶 PDI 及热休克蛋白也在氧化复原平衡调控中有重要作用正常情况下，氧化系统与复原系统处于有机平衡，细胞功能正常一旦氧化系统与复原系统失去平衡，细胞氧化复原环境遭到毁坏，表现出应激和功能异常，持续不平衡将导致衰老及相关疾病，如：动脉硬化、糖尿病、癌症、神经退行性疾病等都与氧化复原失衡密切相关尤其是氧化损伤占主导时，生物大分子功能遭到毁坏，导致衰老发生，即自由基衰老学讲的核心思想 (图 1)氧化复原平衡调控与衰老密切相关超氧化物歧化酶 SOD 对于细胞氧化复原平衡的维持至关重要，过表示出 SOD 能够延长果蝇寿命； SOD2 敲除的 MEF 细胞及小鼠皮肤较之野生型细胞更易发生损伤与老化过氧化氢酶(catalase，CAT)作用于SOD下游，是细胞应对氧化应激的重要抗氧化酶之一CAT 在内皮细胞的病理进程中起重要作用，针对法国人群的研究表示清楚 CAT 能够延缓动脉衰老.另一类重要的自由基去除蛋白是谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)，除了能够去除胞内的过氧化氢之外，GPx 还能够去除过氧化的脂质物质，有研究表示清楚其与心血管疾病的发生存在联络硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)是一个氧化复原酶家族，能够可逆地复原二硫键；通过去除过氧化氢，硫氧还蛋白能够帮助降低细胞氧化应激水平，提高细胞抗氧化能力氧化后的 TRX 通过硫氧还蛋白复原酶(thioredoxin reductase，TRXR)进行复原再生，TRXR 是一种含硒蛋白，它对 TRX 的复原依靠于 NADPH同时，硫氧还蛋白结合蛋白2(trx-binding protein-2，TBP-2)能够调控 TRX 的活性TBP-2 的缺失则会导致脂质代谢失常，这些经过均与衰老经过密切相关研究发现，介入 GSH生物合成的关键限速酶 GCL 活性会随年龄增长降低，在果蝇中过表示出 GCL 能够延长寿命 50%针对酵母衰老时程的研究表示清楚，在衰老经过早期胞内NADPH急剧减少，继而引发 NADPH 依靠的氧化复原酶(如 TRXR、GR 等)氧化失活，造成氧化复原严重失衡，导致含巯基蛋白的大量氧化，氧化复原严重失衡2、氧化复原与信号转导随着细胞分子生物学的快速发展，人们发现活性氧、活性氮等在细胞信号转导中发挥重要作用，如精原干细胞的自我更新就需要活性氧一氧化氮自由基(NO)作为气体信号分子，在免疫系统、心脑血管系统和神经系统发挥重要作用近年研究表示清楚：NO 能够对蛋白质半胱氨酸自由巯基修饰，将 SH 转变为 SNO，即蛋白质巯基亚硝基化修饰 因而，关于细胞氧化复原调控在生命中的作用及在衰老中的作用需要重新和全面认识这里以一氧化氮为例阐述其怎样通过对蛋白质自由巯基亚硝基化修饰(S-nitrosylation，S-nitrosation)调控蛋白质的功能和信号转导(图 2)21巯基亚硝基化对蛋白质活性的调控在巯基亚硝基化的早期研究中，很多代谢相关的酶被鉴定为亚硝基化的靶点，这些酶大多具有活性半胱氨酸残基，在亚硝基化的修饰作用下，活性位点遭到影响，活性也遭到影响，如 GAPDH 的Cys194、谷胱甘肽复原酶(glutathione reductase,GR)的 Cys63、肌酸激酶(creatine kinase, CK) 的Cys283，代谢酶活性的改变导致代谢反响失常后来越来越多的研究发现，巯基亚硝基化修饰不仅仅影响代谢酶类，很多激酶与磷酸酶、膜受体与离子通道、转录因子的活性也都遭到巯基亚硝基化的影响激酶与磷酸酶的亚硝基化后活性的改变直接影响了磷酸化信号的传递，如JNK、蛋白激酶C (PKC)、蛋白酪氨酸磷酸酶 1B (PTP1B)、PTEN等；膜受体与离子通道的亚硝基化可能会影响信号向下游的传递，如NMDA 受体(NMDAR)亚硝基化后活性降低，抑制了下游信号通路、雷诺定受体(RyR)亚硝基化后活性升高，激活了下游信号通路；亚硝基化能够通过影响转录因子与DNA 的结合来调控其转录活性，如 AP-1、NF- B的亚硝基化均抑制了其与 DNA 的结合能力22巯基亚硝基化对蛋白质定位的调控关于巯基亚硝基化影响蛋白质定位的研究较少，就当前的报道来看，巯基亚硝基化能够影响一些蛋白质在细胞质与细胞核之间的转运本来定位于细胞质内的代谢酶 GAPDH 亚硝基化之后与Siah1 蛋白结合能力加强，后者的核输入信号导致二者共同向细胞核内转运，巯基亚硝基化解释了不具备核输入信号的GAPDH 入核的机制巯基亚硝基化对蛋白质定位的调控也是本课题组近年来关注的科学问题，我们的研究发现：NO 通过亚硝基化修饰 93 位以及 310 位半胱氨酸调控 DNA 修复蛋白APE1的核输出，同时毁坏了 importin 介导的核输入系统导致 APE1 在核内全部清空；NO 通过对核输出受体蛋白(CRM1)的亚硝基化修饰，削弱了其与核输出信号 NES 的结合，导致对经典核输出通路的抑制前者是巯基亚硝基化对蛋白质本身定位的影响，后者是巯基亚硝基化通过对核转运蛋白的调控影响其他蛋白质的定位23巯基亚硝基化对蛋白质稳定性的调控蛋白质的泛素化途径是调控其稳定性的主要机制之一巯基亚硝基化修饰可通过影响泛素化途径来调控蛋白质的稳定性这包括两个层次的意义：首先，巯基亚硝基化可影响单个蛋白质的泛素化，对于不同的蛋白质，巯基亚硝基化可能促进其泛素化水平，降低蛋白质稳定性，如 FLICE 样抑制蛋白(FLIP)，可以能降低其泛素化水平，进而维持该蛋白的稳定性，如缺氧诱导因子 1 (HIF-1)、Bcl-2；其次，泛素化系统中关键酶的巯基亚硝基化会影响其底物的稳定性，如巯基亚硝基化抑制了泛素 E3 连接酶 Parkin 的活性，造成其底物蛋白质的降解遭到抑制， -synuclein ( 突触核蛋白)、synphilin-1等的大量聚集引起多巴胺能神经元的大量凋亡24巯基亚硝基化对蛋白质-蛋白质互相作用的调控生物体细胞内的蛋白质互相作用网络是信号转导和一切生理病理经过发生的基础，巯基亚硝基化对蛋白质互相作用的调控也是亚硝基化行使功能的重要机制之一GAPDH 由细胞质向细胞核转位之前，巯基亚硝基化加强其与Siah 的互相作用就是亚硝基化影响蛋白质互相作用的例证之一除此之外，N- 乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)的亚硝基化能够加强其与AMDA 受体(AMDAR) GluR2 亚基的结合，进而调控 AMDAR 下游信号通路p53的77位半胱氨酸残基的亚硝基化能够抑制其与泛素E3连接酶 HDM2 结合，避免其被降解25巯基亚硝基化对蛋白质发生其他类型翻译后修饰的调控巯基亚硝基化影响其他类型翻译后修饰的情况也普遍存在巯基亚硝基化通过对激酶或磷酸酶活性的影响，调控其底物的磷酸化水平，造成某种生理或病理上的效应，如在胰岛素抵抗经过中，胰岛素受体、胰岛素受体底物以及 Akt 的酪氨酸磷酸化水平的降低与其亚硝基化水平的升高相关蛋白质氧化修饰也遭到巯基亚硝基化修饰的影响，有报道指出，蛋白质巯基亚硝基化能够抑制其遭到不可逆氧化修饰的影响，防止其遭到氧化应激的损伤，进而起到保卫的作用，如巯基亚硝基化对硫氧还蛋白和 PTP1B的保卫作用除此之外，组蛋白去乙酰化酶 HDAC2 的巯基亚硝基化能促使其从染色质上解离，加强组蛋白的乙酰化，调控转录，Sumo 化 E3 连接酶 Pias3 的巯基亚硝基化促使其经泛素途径降解，导致细胞 sumo 化整体水平的降低.巯基亚硝基化对蛋白质其他类型翻译后修饰的调控是信号通路之间发生交互作用(crosstalk)的重要机制.3、生物大分子氧化损伤与衰老31 DNA的氧化损伤与修复氧化复原失衡，尤其是当羟自由基这样强氧化的自由基太多时，会造成 DNA 断裂、突变等氧化损伤，8- 羟基 -2 - 脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxy-2 -deoxyguanosine，8-OHdG)是 DNA 氧化损伤的最主要产物和标记物细胞具有多种 DNA 损伤响应机制，能够及时感悟这些损伤，并启动相应的修复通路进行修复但是，当这些损伤超出了细胞的修复能力，DNA 突变逐步积累，细胞基因组稳定性下降基因组不稳定是衰老经过中的重要标志另一方面，线粒体作为内源自由基的主要来源之一，线粒体DNA 极易遭到氧化损伤对于多个物种、多个组织的研究均表示清楚，伴随衰老进程，线粒体DNA (mtDNA)突变累积伴随衰老经过线粒体ROS 增加，细胞氧化应激水平升高，氧化复原敏感的碱基切除修复(base excision repair，BER)关键酶APE-1 由细胞质向细胞核及线粒体转位，以便有效去除DNA 氧化损伤，而过度的氧化损伤可能影响相关修复系统的正常功能，导致 DNA氧化损伤不能及时修复，加速衰老及相关疾病的发展32蛋白质的氧化损伤与堆积蛋白质中半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸等对氧化复原比拟敏感，成为 ROS/RNS 的主要作用靶点，发生多种形式的氧化修饰，一方面直接影响蛋白质的正常功能，另一方面，造成没有功能的蛋白质堆积，导致细胞损伤和死亡研究较早的是蛋白质羰基化修饰，不饱和醛反响或蛋白质本身氧化导致的蛋白质不可逆羰基化直接影响蛋白质折叠和降解.从线虫到人类，伴随衰老羰基化蛋白质的水平是增加的在过氧化亚硝基作用下蛋白质发生酪氨酸硝化，产生 3- 硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)，也是一种不可逆的氧化损伤蛋白质巯基不同程度的氧化及磺酸化都可能导致蛋白质堆积和细胞功能异常研究发现衰老经过中蛋白质降解能力降低、多种酶的催化活性降低除此之外，蛋白质氧化的另一个重要来源是脂质过氧化：不饱和脂肪酸遭到活性氧和活性氮的攻击产生反响活性遐龄命长的脂类自由基以及不饱和醛类，进一步与蛋白质反响损伤细胞的功能上述蛋白质的异常氧化修饰导致了蛋白质稳态异常，是衰老的重要标志之一4延缓衰老和健康衰老的氧化复原调控新策略。延缓衰老和健康衰老一直是人们追求的目的鉴于氧化复原调控在衰老经过中的重要作用，提出下面几个方面作为新的策略参考：a氧化复原平衡的维持活性氧和活性氮的氧化复原调控是一个 双刃剑 ，一方面在有机体中广泛介入细胞的信号转导和生命经过，另一方面能造成生物大分子氧化损伤，影响大分子功能，进而导致衰老及相关疾病的发生要保持细胞正常的生理功能，重要的是怎样保持细胞内的氧化复原平衡，既不能有过度氧化损伤，也不能过度抗氧化而影响正常的氧化复原依靠的信号转导，这在延缓衰老经过中同样重要b氧化复原平衡的系统调控细胞的氧化复原状态是一个系统调控，而不是单一哪一个指标就能代表的，比方，活性氧活性氮是经常检测的氧化复原水平的指标，但生物大分子的氧化可能更有功能相关性经典的氧化酶直接影响氧化复原活性物质的产生，但过渡金属、环境的 pH 值和氧浓度等相关因子也会显著影响细胞的氧化复原水平小分子抗氧化看起来作用直接，但大分子抗氧化可能更有效率因而，首要的问题是建立细胞氧化复原状态的定量的系统描绘叙述，研究在衰老经过中这些不同参数的变化规律，进而在这里基础上系统调控机体的氧化复原平衡，否则，很可能顾此失彼 (图 3)【图】c氧化复原调控的个体化衰老本身是一个个体化的事件，而每个人的氧化复原状态也是各不一样，衰老经过的氧化复原变化因人而异，因而，衰老经过的氧化复原调控只要实现个体化才能真正对症下药这方面的工作任重而道远5、结 语。细胞的氧化复原平衡为胞内各种生物大分子行使正常功能提供了稳定的微环境，氧化复原状态变化将直接影响蛋白质的功能，十分是氧化复原敏感的含巯基蛋白质的功能因而，细胞氧化复原调控与衰老机制不再是简单的 自由基衰老学讲 ，也不再是简单的抗氧化延缓衰老，氧化复原活性小分子与生物大分子的交互作用(crosstalk)是揭示衰老机制的国际前沿，关键蛋白质的氧化复原修饰异常可能是衰老的重要机制衰老经过中氧化复原平衡的维持、氧化复原相关基因的调控机制、氧化复原依靠的蛋白质巯基修饰与信号转导、生物大分子氧化损伤的累积与去除、氧化复原平衡的系统调控及氧化复原状态的个体化表征是细胞氧化复原研究的重要内容，将为揭示衰老机制提供重要根据，为延缓衰老和健康衰老提供新的策略