氧化应激影响成骨细胞功能的研究综述,人体解剖学论文.docx

氧化应激影响成骨细胞功能的研究综述,人体解剖学论文骨质疏松症 osteoporosis,OP 是一种以骨量下降、骨组织微构造毁坏为特征，使骨脆性增加，易发生骨折的代谢性骨病1.随着人口老龄化，其发病率呈逐年上升趋势。氧化应激被以为是介入骨质疏松发生、发展的一个独立危险因素2.氧化应激与绝经后骨质疏松、糖皮质激素性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松发生、发展密切相关3-5.骨质的完好性依靠于成骨细胞的骨构成功能与破骨细胞的骨吸收功能的平衡6,氧化应激可影响成骨细胞功能。本文就氧化应激影响成骨细胞功能的研究进展作一综述。 体内研究 活性氧 reactive oxygen species,ROS 聚集、增加可致氧化应激，其具有双重作用，可氧化、毁坏蛋白质、脂质、DNA,导致细胞功能改变，可以激活胞内多重适应性信号通路7-10.细胞内存在抗氧化系统，华而不实铜锌超氧化物歧化酶 CuZn-SOD发挥重要作用，它由 sod1 基因编码11-12.有文献报道，随年龄增长，sod1 基因敲除小鼠表现为明显骨量下降、骨胶原交联异常，sod1 敲除鼠成骨细胞数量、类骨质外表积、矿化物外表积、骨构成率显着下降13,提示 sod1 基因敲除可致成骨细胞增殖、存活和分化功能下降。提取 sod1 基因敲除鼠原代成骨细胞进行体外培养，发现 sod1 敲除鼠成骨细胞胞内 ROS 含量显着增加、成骨细胞增殖下降、凋亡增加。应用抗氧化剂维生素 C 可逆转sod1 基因敲除对小鼠骨代谢及成骨细胞功能的影响，提示 sod1 敲除鼠骨表型改变主要原因是氧化应激增加，而非 sod1 基因缺失所致。 体外研究 ROS 与细胞凋亡H2O2作为 ROS 的主要成分，可诱导凋亡相关基因 AIF、Bax 和 caspase-3,9 表示出，诱导成骨细胞凋亡14.氧化应激可诱导成骨细胞凋亡已被广泛认可15-16,但 ROS 致成骨细胞凋亡的详细分子机制尚未明确。有研究发现 H2O2可激活胞外信号调节激酶 ERK 表示出，而应用 ERK 上游信号MEK1 /2 抑制剂 PD98059 不仅可降低成骨细胞凋亡率，还可改善 H2O2诱导的 Bax 表示出增加和线粒体膜电位超极化17.提示 ERK 作为线粒体依靠途径的上游信号启动凋亡信号，在 H2O2诱导成骨细胞凋亡经过中发挥积极作用。复原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADPH 氧化酶 4 Nox4 是产生ROS 的重要酶类，H2O2可诱导 MC3T3-E1 细胞氧化应激增加、Nox4 表示出上调和凋亡增加，应用辛伐他汀和 RNAi 技术沉默成骨细胞 Nox4 表示出后，H2O2诱导的细胞损伤显着下降，提示在一定程度上辛伐他汀可通过抑制 Nox4 表示出上调进而保卫成骨细胞免受 H2O2损伤.ROS 的另一主要来源是线粒体，抗毒素 A 可通过线粒体依靠途径增加成骨细胞凋亡、ROS 生成，降低线粒体功能，而用白芍苷预处理后细胞色素 C、心磷脂、线粒体功能增加，最终减弱抗毒素 A 对成骨细胞的氧化损伤. ROS 与细胞增殖 H2O2可抑制成骨细胞增殖，应用抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸 NAC 后成骨细胞增殖明显改善20.Wang 等研究发现不同浓度氟化钠干涉成骨细胞后其胞内 ROS 水平上升、增殖下降、细胞阻滞在 S 期 DNA 合成期 ,提示氟化钠可能通过增加细胞氧化应激抑制增殖、阻滞细胞生长，而另一研究发现维生素 D 所致的 ROS 增加在一定程度上可促进人成骨细胞系 SaOS2 增殖和能量代谢22.提示 ROS 的作用可能与胞内 ROS 水平、作用时间有关。转录因子 FoxO 可保卫多种细胞免于ROS 损伤，在成骨细胞系中 FoxO1 可增加细胞增殖、分化，减少凋亡。FoxO1 作为 miR-182 的作用靶点，其表示出可被 miR-182 抑制，进而降低成骨细胞增殖和分化，损害骨生成23. 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 mTOR 是调节细胞增殖的关键信号分子24,Lia 等25研究发现小剂量、短时间 H2O2刺激可诱导成骨细胞 ROS 增加进而活化 mTORC1,促进细胞增殖。而大剂量、长时间 H2O2刺激诱导胞内 ROS 明显增加，mTOR 表示出下调，抑制细胞增殖，该经过与腺苷酸活化蛋白激酶 AMPK 介导的调控相关蛋白 Raptor S792 磷酸化密切相关。而另一研究则以为H2O2可通过下调细胞周期蛋白 B1 cyclin B1 表示出、诱导 G 2 细胞周期阻滞抑制细胞增 殖，H2O2抑制 mTOR 信号通路在其降低细胞增殖的经过中并无作用26. ROS 与细胞分化大量 研 究 证 明 H2O2可 影 响 成 骨 细 胞 分化27-28.Zhang 等29指出高糖所致的成骨细胞ROS 水平增加可提高碱性磷酸酶 ALP 活性，降低矿化功能，下调 Runt 相关转录因子 2 Runx2 、型胶原蛋白、骨钙蛋白基因表示出，促进过氧化物酶增殖受体 PPAR- 、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白 ap2 基因表示出，ROS 的以上作用可被 NAC逆转。高糖环境下 ROS 通过激活 PI3K/Akt 信号通路进而抑制成骨分化，促进成脂分化。Arai 等28发现，与正常对照组相比，暴露于单一 H2O2无毒浓度的成骨细胞矿化功能下降 50%,调节抗氧化酶的转录因子 Nrf2 基因表示出上调，成骨标志物Runx2、ALP 和骨涎蛋白 BSP 基因表示出显着降低，提示 ROS 致成骨细胞分化下降与抗氧化酶系统表示出上调和成骨基因表示出改变密切相关。Arakak等30发现用促分化培养基培养 MC3T3-E1 细胞14 d,细胞矿化和 ALP、骨钙蛋白基因表示出显着上升，细胞线粒体形态学不断从网状向碎片状变化，胞内 ROS 含量明显增加，而正常培养条件下成骨细胞无明显变化。用 NAC 处理后 ROS 水平、成骨细胞分化功能呈剂量依靠性下降。提示 ROS 作为胞内信号分子，其作用在成骨细胞分化经过中必不可少。 ROS 与自噬 自噬与自噬相关分子： 自噬 autophagy 是溶酶体降解胞内衰老、损伤的细胞器和部分蛋白质、糖类等的一种程序性细胞死亡经过，是细胞对环境的有效反响，以维持细胞本身稳定。该经过由自噬相关基因 autophagy related gene,Atg 调控，Atg最早在酵母菌中发现，当前已发现 34 种 Atg,华而不实大部分都能在哺乳动物中找到同源基因，如 Atg1 同源基因是 ULK UNC-51 like kinase 家族蛋白 ULK1和 ULK2,Atg17 同源基因是 FIP200 focal adhesionkinase family interacting protein of 200 kDa 、Atg6 Beclin1 、Atg8 LC3 .这些基因互相联络，如ULK1 /2-mAtg13-FIP200 复合物的构成可促使细胞自噬的发生31-32.Atg4 可分割微管相关蛋白 1 轻链 3 LC3 前体构成 LC3，随后由 Atg7 依靠的泛素化样系统加工，生成膜结合形式 LC3-，最终将 LC3粘连在自噬体膜上，该经过是细胞自噬的一个重要经过，因而 LC3-被广泛作为自噬标志物，其表示出水平的高低和 LC3-/比值的变化代表了自噬活性的强弱33.LC3-和 Atg12-Atg5结合体是自噬体膜的标志性蛋白质，共同反映自噬活性。p62/SQSTM1 是一种泛素结合蛋白，可与LC3 互相作用进而介导哺乳动物细胞中泛素化蛋白质通过自噬途径被溶酶体降解34,其表示出增加表示清楚自噬活性下降，反之自噬活性增加，它能够作为检测自噬流量大小的标志物35. 自噬与 mTOR: mTOR 是一种保守的丝/苏氨酸激酶，有 mTORC1 和 mTORC2 两种活性形式，它作为细胞内的中心信号调节因子，可接受激素、能量、氧化应激等多种信号刺激36-40.华而不实 mTORC1在调节细胞生长、细胞凋亡、能量代谢和细胞自噬等方面发挥重要作用31,41,mTORC1 可通过磷酸化、调节下游信号分子丝/苏氨酸核糖体蛋白 S6 激酶 1 S6K1 ,继而激活 S6,进而选择性增加编码核糖体蛋白和转录调节因子的 mRNA 翻译42,抑制自噬小体构成。mTOR 受多种上游刺激因子调控，如 AMPK、丝裂原激活蛋白激酶 MAPK 、磷脂 酰 肌 醇-3-羟 激 酶 PI3K 、蛋 白 激 酶 B AKT 等，华而不实 AKT/mTOR/p70S6K 信号通路可负性调节自噬43-44.mTOR/p70S6K 信号通路可调节多种细胞自噬功能45-46,然而其与成骨细胞自147研究发现，无血清培养条件下 MC3T3-E1 细胞自噬相关基因 LC3,beclin1 和 ULK1 及其蛋白表示出显着增加，应用雌激素后自噬进一步加强，且雌激素的该作用与 mTOR磷酸化受抑制有关。 ROS 与细胞自噬： 近年细胞自噬与肿瘤、神经系统疾病、慢性代谢性疾病如糖尿病、骨质疏松等的关系备受关注。无论是正常细胞还是肿瘤细胞，胞内 ROS 水平增加均可诱导自噬48-49.Lu等50研究显示小白菊素可诱导乳腺癌细胞产生ROS,进而激活凋亡和 AMPK-自噬通路。那么 ROS与成骨细胞自噬之间又有何关系呢？ 体外研究51发现 H2O2可激活 MG63 细胞 AMPK 信号通路，增加胞内氧化应激，促进自噬，且 H2O2所致的自噬增加与 AMPK 依靠的 ULKI 激活和 mTORC1 抑制有关。Alberto 等52发现高糖环境下成骨细胞自噬与胞内 ROS 水平密切相关。暴露于高糖培养基中的MC3T3-E1 细胞 ROS 含量、氧化蛋白、自噬显着增加，应用 NAC 后，成骨细胞的以上变化均被逆转，提示高糖环境下成骨细胞 ROS 增加可致自噬增加。 在正常培养条件下 Atg7 基因沉默的成骨细胞胞内ROS 产量和细胞凋亡显着增加，提示自噬功能受损可能增加胞内 ROS,加重细胞氧化损伤。当前高糖环境下 ROS 影响成骨细胞自噬功能的详细分子机制尚未说明，可能与 mTOR 信号通路抑制相关。 自噬与细胞凋亡： 自噬和凋亡关系密切47.为进一步讨论高糖环境下成骨细胞凋亡和自噬之间的互相联络，Alberto 等52应用化学抑制剂和基因沉默等方式方法，发现高糖环境下自噬抑制剂组和Atg7 基因沉默组较单纯高糖组成骨细胞凋亡率显着增加，应用 NAC 后，以上各组成骨细胞活性增加、凋亡减少，提示高糖环境下自噬增加作为一种保卫机制使细胞免于氧化损伤，降低细胞凋亡。 Yang 等应用无血清培养诱导 MC3T3-E1 细胞凋亡、自噬，并用雌激素干涉无血清培养的成骨细胞，发现雌激素可显着减少细胞凋亡，加强细胞自噬，且雌激素可通过 ER-ERK-mTOR 信号通路促进成骨细胞自噬进而减少凋亡。 自噬与细胞分化、增殖： Alberto 等52还观察了成骨细胞自噬与分化的互相关系。他们应用RNA 干扰技术干扰 Atg7 表示出后，与正常培养基组成骨细胞相比，高糖组的成骨细胞分化特异性基因Runx2、Osx、骨钙素 Osteocalcin 表示出和细胞矿化能力显着降低，提示细胞自噬受损可加剧高糖对成骨细胞分化的抑制。当前尚缺乏自噬与成骨细胞增殖间联络的研究。 综上所述，骨质疏松作为一种多病因的慢性代谢性骨病，受多因素影响，如激素水平、年龄、血糖和环境等，这些因素可通过一条共同途径-氧化应激，最终影响成骨细胞功能。氧化应激影响成骨细胞功能的分子机制研究虽已获得重大进展，但仍尚未完全说明。自噬作为一种细胞对环境的适应性改变，可以受氧化应激影响，并可间接影响成骨细胞凋亡、分化，但其对成骨细胞增殖的影响尚待研究。适当降低胞内 ROS 水平、减轻氧化应激可能改善细胞功能，为骨质疏松的防治提供了可能的理论基础。