第四章高效液相色谱课件.ppt

第第4 4章章 高效液相色谱法高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)高压、高速的现代高效液相色谱仪于高压、高速的现代高效液相色谱仪于19671967年面世，年面世，导致高效液相色谱法导致高效液相色谱法(high-performance liquid(high-performance liquid chromatographychromatography，HPLC)HPLC)的产生。的产生。薄壳型填料，柱效薄壳型填料，柱效仅每米仅每米10003000塔板数塔板数510m球型和无定球型和无定型微粒硅胶，每米型微粒硅胶，每米56万理论塔板数万理论塔板数 键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色键合相色谱、离子色谱、疏水色谱、亲和色谱、手性色谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和谱、脂质体色谱、生物膜色谱、整体柱色谱、微径柱和毛细管柱色谱及液相色谱毛细管柱色谱及液相色谱-质谱联用等质谱联用等 http:/ 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点基本特点基本特点 1.高效、高速、高灵敏度 2.填料粒径和流动相性质影响色谱柱效 3局限性 操作条件操作条件 1.流动相对分离选择性的影响 2.柱外效应 3.操作压力 适用范围广适用范围广2023/2/172023/2/17第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 一、液相色谱速率理论一、液相色谱速率理论一、液相色谱速率理论一、液相色谱速率理论影响色谱峰扩展因素影响色谱峰扩展因素影响色谱峰扩展因素影响色谱峰扩展因素 提高柱效的途径，也就是如何提高液相色提高柱效的途径，也就是如何提高液相色谱的分离效率：谱的分离效率：减减 小填料粒度；提高柱内填料装填的均小填料粒度；提高柱内填料装填的均匀性来以加快传质速率。匀性来以加快传质速率。对于液相色谱而言，除了上述的影响因素，还有柱外展宽的影响，所谓柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起的峰扩展。1.吸附色谱(adsorption Chromatography)2.分配色谱(partition Chromatography)3.离子对色谱法（ion pair Chromatography）4.离子交换色谱(ion-Exchange Chromatography)5.离子色谱法(ion Chromatography)6.空间排阻色谱(size Exclusion Chromatography)需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。第三节、高效液相色谱法的主要分离类型及其分离原第三节、高效液相色谱法的主要分离类型及其分离原理理1、吸附色谱、吸附色谱（adsorption chromatography）原原理理：基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。固固定定相相：固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。流动相：流动相：弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。应用：应用：吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法，如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。可分为液可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早液色谱和化学键合相色谱。前者是早期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相，孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相，即化学键合固定相至载体或基质表面。即化学键合固定相至载体或基质表面。化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱类型。类型。2、分配色谱、分配色谱原理：原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。键合固定相非非极极性性键键合合固固定定相相：键合在载体表面的功能分子是烷基、苯 基 等 非 极 性 有 机 分 子。如 最 常 用 的 ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，其极性很小。极极性性键键合合固固定定相相：键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。正相正相HPLC（normal phase HPLC）：）：是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC。反相反相HPLC（reversed phase HPLC）：）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。ODS（Octa Decyltrichloro Silane)3.离子对色谱离子对色谱(Ion Pair Chromatography)在色谱体系中引入一种与样品溶质离子电荷相反的离子对试剂，通常称为对离子或反离子(counterion)，它与溶质离子形成离子对，从而改变溶质在两相中的分配，使离子性溶质的保留行为和分离选择性发生显著变化。常用的离子对试剂有提供阴离子的C4-C8烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、羧酸盐、萘磺酸盐、高氯酸盐等;提供阳离子的季铵盐和烃基胺，如四丁基铵盐、十六烷基三甲基铵盐、三乙胺等。将离子对试剂涂渍在液液色谱的硅胶载体上或溶于流动相中，可构成液液离子对分配色谱，主要用于强极性的有机酸、主要用于强极性的有机酸、有机碱的分离分析。有机碱的分离分析。在反相色谱中，离子对试剂加入缓冲液和甲醇、乙腈等极性有机溶剂的流动相构成反相离子对色谱。4、离子交换色谱、离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）原理：原理：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相，分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时，发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的，的逆过程)：IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不同，从而被相互分离。此法是利用此法是利用离子交换原理和液相色离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法阴离子的一种分离分析方法。凡在溶。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围白质等生物大分子。因此，应用范围较广。较广。离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：5.离子色谱离子色谱(Ion Chromatography，IC)由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的26倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。2023/2/172023/2/17离子色谱具有以下优点：离子色谱具有以下优点：离子色谱具有以下优点：离子色谱具有以下优点：（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀6、空间排阻色谱、空间排阻色谱（又称凝胶色谱和分子筛色谱）以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径（x nmx00 nm）的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。机理：机理：当试样进入凝胶色谱柱时，尺寸过大的分子完全不能渗透到胶孔中去而受到排阻，沿胶粒之间的间隙直接流出色谱柱，产生一个色谱峰；尺寸过小的分子可完全渗透到胶孔中去，流动速度慢，最后流出色谱柱，产生一个色谱峰；中等尺寸的分子，以其大小的不同，可渗透到某些孔穴而不能进入另一些空穴，流出速度取决于分子尺寸的大小,按分子尺寸由大到小的顺序先后流出色谱柱，从而实现分离。应应用：用：适合分离分子量大的化合物（100800,000)，只要相对分子量相差大于10%。2023/2/172023/2/17第四节第四节 液相色谱法固定相液相色谱法固定相一、液一、液液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相1 1担体担体(1)(1)全多孔型担体：全多孔型担体：a.HPLCa.HPLC早期使用的担体与早期使用的担体与GCGC类似，是颗粒均匀的多孔球体，类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 100m100m全多孔全多孔型担体。型担体。缺点：缺点：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂裂隙隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。b.现在采用现在采用10 m全多孔全多孔 型担体，它是由型担体，它是由nm级的硅胶微级的硅胶微粒堆积而成粒堆积而成为为5 m或稍大的全或稍大的全多孔小球。多孔小球。优点：优点：颗粒小而均匀，颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。传质快（距离短），柱效高。2023/2/172023/2/17担体担体担体担体(2)表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：它是直径为它是直径为 30 40 m 的实心核的实心核(玻璃微珠玻璃微珠)，表，表层上附有一层厚度约为层上附有一层厚度约为 1 2m 多孔表面多孔表面(多孔硅胶多孔硅胶)。2固定液 液液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相容。在液-液色谱中常用的固定相也只有极性不同的几种，如，-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。优点：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快,易于填充均匀,柱效高。缺点：柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。这种担体目前应用较为普遍。2023/2/172023/2/17液液液液液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相3化学键合固定相：化学键合固定相：即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面体表面。根据在硅胶表面 (具有具有SiSiOHOH基团基团)的化学反的化学反应不同，键合固定相可分为：应不同，键合固定相可分为：u硅氧碳键型硅氧碳键型(Si(SiO OC):C):u硅氧硅碳键型硅氧硅碳键型(Si(SiO OSiSiC):C):稳定，耐水、耐光、耐有稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广机溶剂，应用最广。u硅碳键型硅碳键型(Si(SiC):C):u和硅氮键型（和硅氮键型（SiSiN):N):2023/2/172023/2/17液液液液液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相液色谱法及离子对色谱法固定相化学键合固定相具有如下一些特点：.表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多；.无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；.可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；.有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。2023/2/172023/2/172023/2/172023/2/17液相色谱法固定相液相色谱法固定相液相色谱法固定相液相色谱法固定相二、液固吸附色谱法固定相二、液固吸附色谱法固定相 采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。三、离子交换色谱法固定相三、离子交换色谱法固定相1.1.薄膜型离子交换树脂薄膜型离子交换树脂:即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约面涂约 1%的离子交换树脂而成。的离子交换树脂而成。2.离子交换键合固定相离子交换键合固定相:用化学反应将离子交换基团键合在用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。惰性担体表面。2023/2/172023/2/17液相色谱法固定相液相色谱法固定相液相色谱法固定相液相色谱法固定相四、排阻色谱法固定相四、排阻色谱法固定相1.1.软质凝胶：软质凝胶：如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。于水为流动相，在常压下使用。2.2.半硬质凝胶：半硬质凝胶：如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。用于非极性有机溶剂。3.3.硬质凝胶：硬质凝胶：如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，多孔硅胶是如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。用得较多的无机凝胶。化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。相性质影响小，可在较高流速下使用。由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：1.1.化化学学惰惰性性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。2.2.适适用用的的物物理理性性质质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等，以降低UV检测器本低响应，提高检测灵敏度;对样品具有适当溶解能力等。3.3.溶溶剂剂清清洗洗和和更更换换方方便便，毒性小、纯度高、价廉等，便于操作和安全。第五节第五节 液相色谱法流动相液相色谱法流动相 选择流动相时应注意下列几个因素：选择流动相时应注意下列几个因素：(1)(1)流动相纯度：流动相纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。测器噪声增加。(2)(2)避免流动相与固定相避免流动相与固定相和被分离组分发生化学反应和被分离组分发生化学反应，而使，而使柱效下降或损坏柱子：柱效下降或损坏柱子：如在液如在液-液色谱中，流动相应与固液色谱中，流动相应与固定液互不相容，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破定液互不相容，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。坏氧化铝固定相等。保证柱的稳定性和分离的重现性。保证柱的稳定性和分离的重现性。(3)(3)对试样要有适宜的溶解度：对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应有适宜的试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。(4)(4)溶剂的粘度小些为好：溶剂的粘度小些为好：否则，会降低试样组分的扩散系否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。数，造成传质速率缓慢，柱效下降。(5)(5)应与检测器相匹配：应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器时，流动例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。相不应有紫外吸收。（6 6）溶剂清洗和更换方便，溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价廉等，毒性小、纯度高、价廉等，便于操作和安全。便于操作和安全。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。缩短。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷己烷 煤油煤油(最小最小)有时还需要选用二元或多元溶剂，以灵活调节流动相的有时还需要选用二元或多元溶剂，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择时选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。要参阅有关手册，并通过实验确定。2023/2/172023/2/17 1.高压输液泵 HPLC使用的高压泵应满足下列条件：a.流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为110 mL/min）；b.能抗溶剂腐蚀；c.有较高的输液压力；对一般分离，60105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150300105Pa。(1)往复式柱塞泵 第六节第六节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2023/2/172023/2/17高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪(2)(2)(2)(2)气动放大泵气动放大泵气动放大泵气动放大泵 2023/2/172023/2/17高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪 2.梯度淋洗装置 梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：a.低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。2023/2/172023/2/17梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度淋洗装置b.高压梯度(或称内梯度系统)：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。2023/2/172023/2/17高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪3.进样装置(1).注射器进样装置：进样所用微量注射器及进样方式与 GC法一样。进样压力150105Pa时，必须采用停流进样。(2).高压定量进样阀：与GC法用的流通法相似，能在高压下进样。其结构如图所示：2023/2/172023/2/174.高效分离柱色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm，长度为 15 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 10m，柱效以理论塔板数计大约 7000 10000。在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。发展趋势是减小填料粒度及柱径和柱长，以提高分析速度和柱效；研制高效柱填料是一活跃领域。在液相色谱中，有两种基本类型的检在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是测器。一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被分离，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下测器介绍如下:5.液相色谱检测器液相色谱检测器 l.l.光吸收检测器：光吸收检测器：紫外吸收检测器紫外吸收检测器，光二极，光二极管阵列检测器，红外吸收检测器管阵列检测器，红外吸收检测器2.2.荧光检测器荧光检测器 3.3.示差折光率检测器示差折光率检测器4.4.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器5.5.电化学检测器电化学检测器 液相色谱检测器液相色谱检测器（1 1）紫外吸收紫外吸收(UV)(UV)检测器检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 1mm 10mm 10mm，容积，容积 8L8L）；对流动相的流速和温）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。光吸收检测器光吸收检测器（2 2 2 2）紫外光紫外光紫外光紫外光电二极管阵列检测器电二极管阵列检测器电二极管阵列检测器电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波波长长，计计算算机机快快速速处处理理，三三维维立立体体谱谱图图，如如图所示。图所示。光吸收检测器光吸收检测器（3）红外吸收检测器红外吸收检测器 与与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。光吸收检测器光吸收检测器 高灵敏度、高选择性高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应.2.荧光检测器荧光检测器(Fluorescence Detector，FD)除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；3.示差折光检测器（示差折光检测器（Differential Refrative Index Detector,RI）示差折光检测器光路示差折光检测器光路4.2.5.3.示差折光检测器（示差折光检测器（Differential Refrative Index Detector,RI）4.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(Evaporation Light Scattering Detector,ELSD)1.色谱柱出口;2.液压释放口;3.氮气入口;4.雾化器;5.加热漂移管;6.样品液滴;7.激光光源;8.排气口;9.光电检测器;10.放大器;11.连接记录系统。A.色谱柱洗出液雾化区；B.溶剂蒸发区;C.样品粒子光散射。5.电化学检测器电化学检测器 基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测，主要有安培、极谱及电导等几种类型，适用于测定具有电化学氧化还原性质及电导的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机阴、阳离子等。1.氟塑料池体,2.工作电极,3.氟塑料或聚酯垫片,4.接参比电极，至废液，5.接色谱柱。第八节第八节 高效法应用实例高效法应用实例高效液相色谱法更适于分离、分析高沸点、热稳定性差、生理活性及相对分子量较大的物质，因而广泛应用于核算、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢物、生物大分子、表面活性剂、抗氧化剂等分析中。液相色谱随着实验方法的大量开发和成熟，目前应用领域非常广泛；高校：食品、生命、环境等相关专业用的较多（也有个别专业应用）；制药厂、化工厂：检测原料或者成品中的有效成分的含量；食品检测：检测其中的添加物，如三聚氰胺三聚氰胺、苏丹红苏丹红、孔孔雀石绿雀石绿等；政府相关的职责部门：质检、商检、药监科研院所：大多数也和上面提到的各个方面相关 第九节第九节 液相液相制备制备色谱简介色谱简介 制备色谱是分离、收集一种或多种色谱纯组分，供进一步使用。与分析分离的区别是色谱柱尺寸、柱容量更大。评价制备色谱方法的主要指标是:1.最大允许分离样品体积或量(色谱柱负荷);2.单位时间内分离纯物质的量,即产率;3.淋洗溶剂量或样品在分离中的稀释度。影响制备色谱产率的主要因素有:1.产率随柱长、柱内径、柱效升高而增加，但不呈线性关系。2.比较获得相同产率使用粗(2540m)或细(10m)不同颗粒填料，操作条件各有优缺点。3.制备分离的目标组分要求有比较高的分离选择性值，可允许较大进样量。4.制备色谱经常在柱超负荷条件下操作，一般适当降低进样浓度，保持在线性分布范围，用增加进样体积提高进样量以提高产率。5.以硅胶为填料的正相色谱通常是制备分离首选方法，低沸点有机溶剂易于回收，具有成本低的优点。但对各种特殊分离，如对映体，蛋白质等需采用手性、弱疏水性填料。