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第三章第三章 生物制品的制备生物制品的制备P62P62一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （1 1）原料选择）原料选择v原料的选择原则原料的选择原则：有效成分含量高，新鲜；有效成分含量高，新鲜；原料来源丰富，产地较近；原料来源丰富，产地较近；原料中杂质含量少；原料中杂质含量少；原料成本低等。原料成本低等。第一节第一节 一般生物制品的制备方法一般生物制品的制备方法 植物原料生长的季节性；植物原料生长的季节性；微生物原料的对数期；微生物原料的对数期；动物原料的年龄与性别。动物原料的年龄与性别。原料的选择注意事项：原料的选择注意事项：动物原料动物原料：采集后要立即处理，去除结缔：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。植植物物原原料料：要要择择时时采采集集并并就就地地去去除除不不用用的的部分，保鲜处理；部分，保鲜处理；微微生生物物原原料料：要要及及时时将将菌菌细细胞胞与与培培养养液液分分开，进行保鲜处理。开，进行保鲜处理。v（2 2）原料的预处理与保存：）原料的预处理与保存：冷冷冻冻法法。该该方方法法适适用用于于所所有有生生物物原原料料。常常用用-40-40速冻。速冻。有有机机溶溶剂剂脱脱水水法法。常常用用的的有有机机溶溶剂剂是是丙丙酮酮。该该法法适适用用于于原原料料少少而而价价值值高高、有有机机溶溶剂剂对对活活性性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。防防腐腐剂剂保保鲜鲜。常常用用乙乙醇醇、苯苯酚酚等等。该该法法适适用用于液体原料，如发酵液、提取液等。于液体原料，如发酵液、提取液等。v原料的保存方法：原料的保存方法：生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法：的。常用的破碎方法：二、生物制品的提取二、生物制品的提取细胞破碎细胞破碎v定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏的方法来破坏细胞壁细胞壁或或细胞膜细胞膜v目的：目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。放出来，获得有效的提取。l细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度及纯度l动物细胞动物细胞:多分泌到细胞外培养液多分泌到细胞外培养液l植物细胞植物细胞:多为胞内产物多为胞内产物l微生物（细菌微生物（细菌/真菌）真菌）:胞内、胞外胞内、胞外 v对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。破碎。不同类型的细胞分泌目标产物的不同类型的细胞分泌目标产物的类型：类型：(大多数情况下，大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤尤其其是是由由基基因因工工程程菌菌产产生生的的大大多多数数蛋蛋白白质质是是在细胞内沉积。在细胞内沉积。l脂类物质和一些抗生素脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。包含在生物体中。提取提取细胞破碎细胞破碎溶剂溶剂溶剂层溶剂层不溶性物质不溶性物质沉淀沉淀离心离心一、机械破碎方法一、机械破碎方法l通过机械运动所产生的通过机械运动所产生的剪切力剪切力的作用，使的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。细胞破碎的方法称为机械破碎法。常用的仪器常用的仪器高速组织捣碎机高速组织捣碎机匀浆器匀浆器研磨器研磨器高速组织捣碎机高速组织捣碎机手提式匀浆器手提式匀浆器l 研杆研杆管管匀浆器研杆及管的横载面匀浆器研杆及管的横载面几百微米的间隙台式匀浆器台式匀浆器研磨器研磨器l 物理破碎方法物理破碎方法l通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。方法，统称为物理破碎方法。l物理破碎方法多用于物理破碎方法多用于微生物细胞微生物细胞的破碎。的破碎。v物理破碎法的分类物理破碎法的分类物理破碎法物理破碎法温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法超声波细胞破碎机超声波细胞破碎机v化学破碎方法化学破碎方法l化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。l常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。两大类。l十二烷基硫酸钠：十二烷基硫酸钠：SDSv酶学酶学破碎方法破碎方法l酶学破碎方法：酶学破碎方法：利用利用溶解细胞壁溶解细胞壁的酶的酶(外加的或外加的或细胞本身存在的酶细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜膜l分为：外加酶制剂和自溶法。分为：外加酶制剂和自溶法。自溶作用自溶作用 l 自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。以达到自溶目的。l缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。粘度增大，过滤速度下降。（2 2）提取（）提取（extraction）生生物物组组织织与与细细胞胞破破碎碎后后要要立立即即进进行行提提取取。提提取取时，首先要根据活性物质的性质，时，首先要根据活性物质的性质，选选择择提提取取试试剂剂。提提取取试试剂剂主主要要有有：水水、缓缓冲冲溶溶液液、盐盐溶溶液液、乙乙醇醇、其其他他有有机机溶溶剂剂（如如氯氯仿仿、丙丙酮等）。酮等）。考考虑虑提提取取溶溶剂剂的的用用量量及及提提取取次次数数、提提取取时间。时间。注意提取的温度、注意提取的温度、pHpH、变性剂等因素。、变性剂等因素。包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：1.1.沉淀法沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂盐析法、有机溶剂沉淀法沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等电点沉淀法、选择性沉淀法等。等。第二节第二节 各类生物制品的分离纯化方法各类生物制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化方法一、蛋白质类制品的分离纯化方法(2)(2)按分子大小分离的方法：按分子大小分离的方法：有有超滤法超滤法和和透折法透折法、凝胶层析法凝胶层析法、超速离心法超速离心法等。其等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。分级和脱盐。(3)(3)按分子所带电荷进行分离的方法按分子所带电荷进行分离的方法氨氨基基酸酸、多多肽肽、蛋蛋白白质质、酶酶均均为为两两性性电电解解质质。它它们们具具有有等等电电点点，在在离离开开等等电电点点的的pHpH时时便便会会带带正正或或负负电电荷荷。例例如如某某蛋蛋白白质质等等电电点点为为7.07.0，当当溶溶液液pHpH为为4.04.0时时，分分子子则则带带有有正正电电荷荷。由由于于具具有有该该性性质质，利利用用带带电电性性质质进进行行分分离离是是极极其其有有效效的的方方法法。利利用用电电学学性性质质进进行行分分离离的的方方法法有有离离子子交交换换层层析析、电电泳泳法法、等电点聚焦法等电点聚焦法等。等。（4 4）亲和层析法）亲和层析法大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。析分离技术称为亲和层析。亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。广泛的分离方法之一。v核酸类药物生产方法主要有核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法提取法和发酵法。提取法提取法生产生产DNADNA和和RNARNA，先提取核酸和蛋白质复先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离，然后分离RNARNA与与DNADNA。发酵法发酵法主要用于生产主要用于生产单核苷酸。二、核酸类制品的分离纯化方法二、核酸类制品的分离纯化方法 由由于于各各种种糖糖类类制制品品的的性性质质和和原原料料来来源源不不同同，没没有有统统一一规规范范的的提提取取和和纯纯化化工工艺艺。这这里里只只介介绍绍多多糖糖和和粘粘多多糖糖的的一一般般分分离纯化方法。离纯化方法。三、糖类制品的分离纯化方法三、糖类制品的分离纯化方法非降解法非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。降降解解法法适适用用于于从从组组织织中中提提取取结结合合比比较较牢牢固固的的粘粘多多糖糖。如如从从软软骨骨中中分分离离提提取取硫硫酸酸软软骨骨素素，就就是是用用碱碱处处理理进进行行降降解解。又又如如用用酶酶处处理理法法可可提提取取与与蛋蛋白白质结合的多糖。质结合的多糖。（1）提取方法）提取方法 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。乙乙醇醇沉沉淀淀法法：是是从从提提取取液液中中沉沉淀淀多多糖糖的的最最简简易易方方法法，也也适适用用于于分分级级分分离离。4-54-5倍倍体体积积的的乙乙醇醇可可以以使使任任何何结结缔缔组组织织中中的的粘粘多多糖糖完完全全沉沉淀淀。用用季季铵铵化化合合物物也也可可沉沉淀淀粘粘多多糖糖。粘粘多多糖糖的的聚聚阴阴离离子子能能与与某某些些阳阳离离子子表表面面活活性性剂剂结结合合成成不不溶溶于于水水的的盐，如十六烷基三甲基铵（盐，如十六烷基三甲基铵（CTACTA）等。等。（2）分离方法）分离方法（1 1）提取方法（）提取方法（extraction extraction）脂脂类类自自然然状状态态下下是是以以结结合合形形式式存存在在的的。非非极极性性脂脂是是与与其其他他脂脂质质分分子子或或蛋蛋白白质质分分子子的的疏疏水水区区相相结结合合的的。提提取取脂脂质质就就是是要要选选择择适适当当的的溶溶剂剂来来破破坏坏这这种种结结合合键键，将将脂脂质质溶溶解解出出来来。常常用用的的溶溶剂剂有有组组合合溶溶剂剂，醇醇是是其其中中的的主主要要成成分分，此此外外还还有有氯氯仿仿、甲醇、水等。甲醇、水等。四、脂类制品的分离纯化方法四、脂类制品的分离纯化方法 沉淀法沉淀法：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。故常用它进行沉淀。吸附层析法吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出性的后流出。（2）纯化方法）纯化方法离离子子交交换换层层析析法法:脂脂质质分分子子的的存存在在有有非非解解离离、两两性性离离子子和和酸酸式式解解离离三三种种状状态态。根根据据它它们们在在一一定定pHpH条条件件下下的的解解离离情情况况，选选择择适适当当的的离离子子交交换换剂剂可可将将它它们们提提纯纯。如如TEAETEAE纤纤维维素素对对分分离离脂脂肪肪酸酸和和胆胆汁汁酸酸等等特特别有效。别有效。（1）氨基酸的生产方法）氨基酸的生产方法蛋白质水解法蛋白质水解法：水解法水解法有酸水解有酸水解、碱水解和碱水解和酶水解三种酶水解三种。五、氨基酸类制品的分离纯化方法五、氨基酸类制品的分离纯化方法 用用盐酸水解盐酸水解为常用方法，其优点是水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是迅速、完全，产物全部是LL型氨基酸，型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。分被破坏。碱水解法碱水解法易产生消旋作用，较少应用。易产生消旋作用，较少应用。酶水解法酶水解法水解不够完全。水解不够完全。发酵法发酵法：菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。化学合成与酶促合成法化学合成与酶促合成法化化学学合合成成法法一一般般得得到到的的是是DL型型氨氨基基酸酸，尚尚需需要要对对异异构构体体拆拆分分；酶酶促促合合成成法法也也是是酶酶工工程程在在医医药药工工业业上上的的应应用用，优优点点是是技技术术工工艺艺简简单单，转化率高，副产物少和易提纯等。转化率高，副产物少和易提纯等。有有沉淀法、吸附法和离子交换法沉淀法、吸附法和离子交换法。沉沉淀淀法法：根根据据形形成成沉沉淀淀的的原原理理不不同同分分为为两两种种：是是依依据据不不同同氨氨基基酸酸在在水水中中或或其其他他溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度差差异异进进行行沉沉淀淀分分离离。是是用用特特殊殊试试剂剂沉沉淀淀某某种种氨氨基基酸酸，如如用用邻邻二二甲甲苯苯-4-磺磺酸酸与与亮亮氨氨酸酸形形成成不不溶溶性性盐盐沉沉淀淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。（2）氨基酸的分离方法）氨基酸的分离方法 吸吸附附法法：这这是是利利用用吸吸附附剂剂根根据据氨氨基基酸酸吸吸附附力力的的差差异异进进行行氨氨基基酸酸分分离离的的方方法法。苯苯丙丙氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸的的分分离离就就是是利利用用活活性性炭炭对对其其吸附的原理。吸附的原理。离离子子交交换换法法：氨氨基基酸酸是是两两性性电电解解质质，在在一一定定pHpH条条件件下下，不不同同氨氨基基酸酸带带电电性性质质及及解解离离状状态态是是不不相相同同的的，因因此此在在离离子子交交换换剂剂上上被被吸吸附附的的强强度度不不同同。常常用用的的离离子子交交换换剂剂为为强强酸酸型型阳阳离子交换树脂，洗脱主要用离子交换树脂，洗脱主要用pHpH梯度洗脱。梯度洗脱。基因工程产物的特点：基因工程产物的特点：1.产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎2.产物浓度较低，杂质多，提纯困难产物浓度较低，杂质多，提纯困难3.产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活第三节第三节 基因工程制品的分离纯化方法基因工程制品的分离纯化方法 1、含目的产物的起始物料的特点、含目的产物的起始物料的特点 各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。这些因素包括：这些因素包括：菌菌种种类类型型及及其其代代谢谢特特性性。包包括括菌菌种种的的各各种种生生物物学学性性质质，产产物物和和副副产产物物种种类类、产产物物在在细细胞胞内内所所处处的的位位置置，表表达达方方式式，代代谢物种类，产物类似物、毒物和能降解产物的酶类等；谢物种类，产物类似物、毒物和能降解产物的酶类等；一、影响分离纯化工艺设计的主要因素一、影响分离纯化工艺设计的主要因素一、影响分离纯化工艺设计的主要因素一、影响分离纯化工艺设计的主要因素原材料和培养基的来源及其质量；原材料和培养基的来源及其质量；生产工艺和条件。生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方包括灭菌方法和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件、因素及方式等；工艺控制条件、因素及方式等；初始物料的物理、化学和生物学特性。初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、解度、pH、粘度、流体力学性质和热力学性质等。、粘度、流体力学性质和热力学性质等。2、物料中杂质的种类和性质、物料中杂质的种类和性质杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分杂质的含量、化学性质、结构、相对分子量、电荷性质及数量、生物学特性、子量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。吸附性能等。3、目的产物特性、目的产物特性产物特性主要有化学、物理和生物学特产物特性主要有化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。类、表面活性等。4、产品质量的要求、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。型、贮存稳定性等。二、分离纯化的基本过程二、分离纯化的基本过程分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；低，杂质含量却很高；另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。分离纯化一般不应超过分离纯化一般不应超过4 45 5个步骤，个步骤，包括细胞破碎包括细胞破碎 、固液分离、浓缩与初、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。成品加工。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品一般制品分离纯化的一般流程一般制品分离纯化的一般流程一般制品分离纯化的一般流程一般制品分离纯化的一般流程1 1、根据产物表达形式来选择、根据产物表达形式来选择分泌型表达产物分泌型表达产物的发酵液的体积很大、但的发酵液的体积很大、但浓度较低，必须在纯化前进行浓缩，可用浓度较低，必须在纯化前进行浓缩，可用沉沉淀和超滤淀和超滤的方法浓缩。的方法浓缩。二、选择分离纯化方法的依据二、选择分离纯化方法的依据 P80 P80产物在产物在周质表达周质表达是介于细胞内可溶性表达和是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。度上有利于分离纯化。为了获得为了获得周质蛋白周质蛋白，E.E.colicoli经低浓度溶菌酶经低浓度溶菌酶处理后，可采用处理后，可采用渗透压裂解渗透压裂解的方法来获得，能的方法来获得，能够回收到高质量的产物。够回收到高质量的产物。E.E.colicoli细胞内可溶性表达产物破菌后细胞内可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选的细胞上清，首选亲和分离方法亲和分离方法。如果。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，性的亲和配基，一般先用离子交换色谱一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。离能去掉大部分的杂质。应选择不同机制的分离单元来组成一应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手段，先将含量最多的杂质分离去除，手段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。后阶段。2 2、根据分离单元之间的衔接选择、根据分离单元之间的衔接选择v即通常：即通常：v先选用非特异、低分辨的操作单元先选用非特异、低分辨的操作单元（如（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；括非蛋白类杂质）；v随后采用高分辨率的操作单元随后采用高分辨率的操作单元（如具有（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；v凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后度慢的操作单元放在最后。色谱分离次序的选择同样重要色谱分离次序的选择同样重要色谱次序能够提高分离效率，当几种方法连用时，色谱次序能够提高分离效率，当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，经前一种方法处最好以不同的分离机制为基础，经前一种方法处理的样品应能适合于作为后一种方法的料液理的样品应能适合于作为后一种方法的料液，不，不必经过脱盐、浓缩等处理。必经过脱盐、浓缩等处理。p如经盐析后得到的样品，不适宜于离子交换层如经盐析后得到的样品，不适宜于离子交换层析，但对疏水层析则可直接应用。析，但对疏水层析则可直接应用。离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质浓缩的效应蛋白质浓缩的效应凝胶过滤色谱常常使样品稀释凝胶过滤色谱常常使样品稀释在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适，不必经过缓冲液的更换就很合适，不必经过缓冲液的更换亲和层析选择性最强，但不能放在第一亲和层析选择性最强，但不能放在第一步：一方面因为杂质多，易受污染，另一步：一方面因为杂质多，易受污染，另一方面，体积较大，需用大量的介质，因此方面，体积较大，需用大量的介质，因此亲和层析多放在第二步以后。亲和层析多放在第二步以后。分离纯化的技术分离纯化的技术分离纯化技术应满足下列要求：分离纯化技术应满足下列要求：技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；选择性要好，达到较高纯化倍数；选择性要好，达到较高纯化倍数；收率要高；收率要高；要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。分离纯化工艺应遵循以下原则：分离纯化工艺应遵循以下原则：（1 1）工艺条件应）工艺条件应温和温和，具有良好的，具有良好的稳定性和稳定性和重复性重复性：不受或少受发酵工艺、条件及原材料：不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，在任何环境下使用都应具有重复来源的影响，在任何环境下使用都应具有重复性，明确需严格控制的步骤和技术性，明确需严格控制的步骤和技术（2 2）尽可能）尽可能减少组成工艺的步骤减少组成工艺的步骤：步骤越多，：步骤越多，产品的后处理收率越低，但必须保证产品的质产品的后处理收率越低，但必须保证产品的质量量3 3、根据分离纯化工艺的要求来选择、根据分离纯化工艺的要求来选择（3 3）组成工艺的各技术或步骤之间要）组成工艺的各技术或步骤之间要相互相互适应和协调适应和协调（4 4）在工艺过程中要）在工艺过程中要尽可能少用试剂尽可能少用试剂，以，以免增加步骤，或干扰产品质量免增加步骤，或干扰产品质量（5 5）时间要尽可能短时间要尽可能短，因稳定性差的产物，因稳定性差的产物随工艺时间增加，生物活性收率会降低，产品随工艺时间增加，生物活性收率会降低，产品质量会下降质量会下降（6 6）必须高效、收率高、易操作必须高效、收率高、易操作，对设备，对设备条件要求低，能耗低条件要求低，能耗低（7 7）具有较高的安全性具有较高的安全性：药品必须保证安：药品必须保证安全、无菌、无热原、无污染全、无菌、无热原、无污染三、各种不同表达形式的产物 采用的分离纯化方法（P81）v（一）一）细胞内不溶性产物细胞内不溶性产物包含体包含体大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物式产生并聚集形成蛋白质聚合物包含体包含体以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，因此构，表达蛋白不具有生物活性，因此在纯化过程中必须溶在纯化过程中必须溶解包含体并对表达蛋白进行解包含体并对表达蛋白进行复性复性。步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分变性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离离（二）分泌型的表达产物（P83）v分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以前进行浓缩在纯化以前进行浓缩v浓缩方法包括：沉淀、超滤浓缩方法包括：沉淀、超滤（三）细胞内可溶性表达产物（四）细胞周质表达蛋白v周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。纯化。为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用一般用渗透压裂解法渗透压裂解法获取。获取。由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白无蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白产物。产物。一、原材料的质量检测与控制一、原材料的质量检测与控制原材料的质量控制是要确保编码生物制品的原材料的质量控制是要确保编码生物制品的DNADNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性保证产品质量的安全性和一致性。和一致性。第四节第四节 生物制品的质量检测与控制生物制品的质量检测与控制P90P90 在工程菌菌种贮存中，要求在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的在培养过程中，要求工程菌所含的重组质粒稳定重组质粒稳定，始终无突变；始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌在重复生产发酵中，工程菌表达稳定表达稳定；始终能排；始终能排除外源微生物污染。除外源微生物污染。二、培养过程的质量控制二、培养过程的质量控制 产品应有种子批系统，并证明种子批不含致产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。并由原始种子批建立生产用工作细胞库。p原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNA序列，详细叙序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。产品要有足够的生理和生物学试验数据，产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持确证提纯物分子批间保持一致性一致性；外源蛋白；外源蛋白质、质、DNADNA与热原质都控制在规定限度以下。与热原质都控制在规定限度以下。三、纯化工艺过程的质量控制三、纯化工艺过程的质量控制v基因工程药物质量控制主要包括基因工程药物质量控制主要包括：产品的鉴别、产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。1 1、产品的鉴别、产品的鉴别n有许多方法可用于全面鉴定，如下表：有许多方法可用于全面鉴定，如下表：四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法电泳方法：电泳方法：SDS-PAGESDS-PAGE，等电点聚焦，免疫电泳，等电点聚焦，免疫电泳免疫学分析方法：放免法，放射性免疫扩散法免疫学分析方法：放免法，放射性免疫扩散法酶联免疫吸附法，免疫印渍酶联免疫吸附法，免疫印渍受体结合试验受体结合试验各种高效液相分析法各种高效液相分析法肽图分析法肽图分析法Edman NEdman N末端序列分析法末端序列分析法圆二色谱圆二色谱核磁共振核磁共振2 2、纯度分析、纯度分析它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析两个方面的内容。方面的内容。p（1 1）目的蛋白质含量测定）目的蛋白质含量测定 通常采用的方法有还原性及非还原性通常采用的方法有还原性及非还原性SDS-PAGESDS-PAGE、等电点聚焦、各种等电点聚焦、各种HPLCHPLC、毛细管电泳（毛细管电泳（CECE）等。等。p（2 2）杂质）杂质 蛋白类杂质蛋白类杂质 非蛋白类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、非蛋白类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原质、内毒素、致敏原及热原质、内毒素、致敏原及DNADNA。3 3、生物活性测定、生物活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，需是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。测定。重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或重组蛋白质是一种抗原，可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。酶标法测定其免疫学活性。体内生物活性的测定要建立适合的生物学模型。体内生物活性的测定要建立适合的生物学模型。体外生物活性测定的方法有细胞培养计数法、体外生物活性测定的方法有细胞培养计数法、3 3H-H-TRTR掺入法和酶法细胞计数等。掺入法和酶法细胞计数等。4 4、稳定性检测、稳定性检测稳定性检测是评价药品有效性和安全性的重稳定性检测是评价药品有效性和安全性的重要指标之一。要指标之一。5 5、产品一致性的保证、产品一致性的保证v1 1、液态保存液态保存v（1 1）低温保存低温保存：液态蛋白质样品在：液态蛋白质样品在-10-10-20-20以下冰冻保存比较理想。以下冰冻保存比较理想。v（2 2）超低温保存：液氮超低温保藏超低温保存：液氮超低温保藏v（3 3）在稳定在稳定pHpH条件下保存条件下保存：蛋白质较稳：蛋白质较稳定的定的pHpH一般在等电点，因而保存液态蛋白一般在等电点，因而保存液态蛋白质样品时，调到其稳定的质样品时，调到其稳定的 pHpH范围内。范围内。第五节第五节 生物制品的保存与运输生物制品的保存与运输 P97 P97v（4 4）高浓度保存高浓度保存：一般蛋白质在高：一般蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，这是因为液态蛋浓度溶液中比较稳定，这是因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，保存时浓白质容易受水化作用的影响，保存时浓度不能太低，否则可能引起亚基解离和度不能太低，否则可能引起亚基解离和表面变性。表面变性。v（5 5）加保护剂保存加保护剂保存：加入某些稳定：加入某些稳定剂可以降低蛋白质溶液的极性，以免变剂可以降低蛋白质溶液的极性，以免变性失活。性失活。v一般蛋白质一般蛋白质含水量超过含水量超过10%10%时容易失活时容易失活。含水量含水量降到降到5%5%时，在室温或冰箱中保存均比时，在室温或冰箱中保存均比较稳定，在较稳定，在干燥器中在干燥器中在44以下以下可保存相当可保存相当长的时间。长的时间。2 2、固态保存、固态保存