生物传感器检测原理类型精.ppt

生物传感器检测原理类型第1页，本讲稿共55页2.1 2.1 生物传感器定义、结构生物传感器定义、结构o生物传感器定义生物传感器定义 生物传感器(biosensor)是用生物活性材料生物活性材料(酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理换能器物理换能器有机结合的器械或装置，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法。第2页，本讲稿共55页o生物传感器的结构生物传感器的结构(组成组成)根据定义，包括两部分两部分：1、生物活性材料生物活性材料(也叫生物敏感膜生物敏感膜、分子识分子识别元件别元件)。2、物理换能器物理换能器(也叫传感器)2.1 2.1 生物传感器定义、结构生物传感器定义、结构第3页，本讲稿共55页2.1 2.1 生物传感器定义、结构生物传感器定义、结构 表2-1 生物传感器的生物敏感膜（分子识别元件）生物敏感膜生物敏感膜 生物活性材料生物活性材料生物敏感膜生物敏感膜生物活性材料生物活性材料酶各种酶类全细胞细菌、真菌、动植物细胞免疫物质抗体、抗原、酶标抗原细胞器线粒体、叶绿体DNA寡聚核苷酸组织动植物组织切片具有亲和能力的物质配体、受体模拟酶高分子聚合物生物敏感膜生物敏感膜(biosensitive membrane)又称为分子识别元件(molecular recognition element)是生物传感器的关键元件(表2-1)，直接决定传感器的直接决定传感器的功能功能与与质量质量。依生物敏感膜所选用材料不同，其组成可以是酶、DNA、免疫物质、全细胞、组织、细胞器或它们的组合，近年还引入了高分子聚合物模拟酶，使分子识别元件的概念进一步延伸。第4页，本讲稿共55页2.1 2.1 生物传感器定义、结构生物传感器定义、结构生物学反应信息生物学反应信息换能器选择换能器选择生物学反应信息生物学反应信息换能器选择换能器选择离子变化离子选择性电极光学变化光纤、光敏管电阻、电导变化阻抗计、电导仪颜色变化光纤、光敏管质子变化场效应晶体管质量变化压电晶体等气体分压变化气敏电极力变化微悬臂梁热焓变化热敏电阻、热电偶振动频率变化表面等离子共振 换能器(transducer)又称为传感器(sensor),其作用是将各种生物的、化学的和物理的信息转变成电信号。生物反应过程产生的信息是多元化的，微电子和传感技术的现代成果为检测这些信息提供了丰富的手段，使得研究者在设计生物传感器时对换能器的选择有足够的回旋余地。设计的成功与否主要取决于设计方案的科学性和经济性，可供制作生物传感器的基本换能器如下表(2-2)表2-2 生物学反应信息和换能器的选择第5页，本讲稿共55页2.2 生物传感器的原理生物传感器的原理 待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号转变成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物浓度。图示生物传感器原理：电信号电信号待检测物待检测物生生物物敏敏感感膜膜物理变化物理变化此界面发生生此界面发生生物学反应物学反应(分分子识别过程子识别过程)此界面发生能此界面发生能量转换量转换(转换转换成电信号成电信号)此处发生信号转此处发生信号转换换(模拟信号转模拟信号转换成数字信号换成数字信号)换换 能能 器器计计 算算 机机第6页，本讲稿共55页2.3 生物传感器的分类生物传感器的分类按分子识别元件分类按分子识别元件分类和按换能器类型分类按换能器类型分类。分子识别元分子识别元件分类法件分类法分子印记分子印记生物传感器生物传感器微生物微生物生物传感器生物传感器DNA生物传感器生物传感器细胞细胞生物传感器生物传感器组织组织生物传感器生物传感器免疫免疫生物传感器生物传感器酶酶生物传感器生物传感器换能器换能器分类法分类法悬臂梁悬臂梁生物传感器生物传感器阻抗阻抗/电导电导生物传感器生物传感器声波声波生物传感器生物传感器电化学电化学生物传感器生物传感器半导体半导体生物传感器生物传感器热热生物传感器生物传感器光光生物传感器生物传感器第7页，本讲稿共55页2.4 生物传感器的优点生物传感器的优点 (1)(1)可重复使用可重复使用 采采用用固固定定化化生生物物活活性性物物质质作作催催化化剂剂，价价格格昂昂贵贵的的试试剂剂可可以以重重复复多多次次使使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。(2)(2)专一性强专一性强(选择性高、特异性强选择性高、特异性强)如：酶只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。如：酶只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响。(3)(3)分析速度快分析速度快 可以在几分钟得到结果。可以在几分钟得到结果。(4)(4)准确度高准确度高 一般相对误差可以达到一般相对误差可以达到1 (5)(5)操作系统比较简单操作系统比较简单 ，容易实现自动分析，容易实现自动分析 (6)(6)成本低成本低 在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。在连续使用时，每例测定仅需要几分钱人民币。第8页，本讲稿共55页 20世纪九十年代至今我国生物传感器研究队伍逐渐扩大，其标志之一是近10年来在中国国内期刊上发表的以生物传感器为关键词的论文总数达到650篇，其中2003年的论文数量比1994年增加了约一倍。近十年的该领域专家的研究背景也从生物学扩大到化学和电子学。表明了生物传感器领域学科相互交叉的趋势。近十年来在中国期刊发表的生物传感器论文近十年来在中国期刊发表的生物传感器论文 年份年份 19941994 19951995 19961996 19971997 19981998 19991999 20002000 20012001 20022002 20032003论文数量论文数量484864643636474751515656676766661181189090第9页，本讲稿共55页生物传感检测的生物学理论生物传感检测的生物学理论分子识别及生物反应基础分子识别及生物反应基础主要内容主要内容o酶及酶反应酶及酶反应o微生物反应微生物反应o免疫反应免疫反应o核酸及核酸反应核酸及核酸反应o生物学反应中的物理量变化生物学反应中的物理量变化第10页，本讲稿共55页概述概述 生物传感器的分子识别元件又叫敏感元件，主要指来源于生物体的生物传感器的分子识别元件又叫敏感元件，主要指来源于生物体的生物活性物质，包括酶、抗原、抗体和各种功能蛋白质、核酸、微生生物活性物质，包括酶、抗原、抗体和各种功能蛋白质、核酸、微生物细胞、细胞器、动植物组织等。物细胞、细胞器、动植物组织等。当它们用做生物传感器的敏感元件时，都无一例外地具有对当它们用做生物传感器的敏感元件时，都无一例外地具有对靶分子靶分子(待检测对象待检测对象)特异的识别功能。分子识别常常是生物体进行特异的识别功能。分子识别常常是生物体进行各种简单反应或复杂反应的前奏。生物反应包括了生理生化、遗传变各种简单反应或复杂反应的前奏。生物反应包括了生理生化、遗传变异和新陈代谢等一切形式的生命活动，异和新陈代谢等一切形式的生命活动，生物传感器研究者的任务就生物传感器研究者的任务就是将生物反应与传感器技术有机结合起来是将生物反应与传感器技术有机结合起来。这里介绍这里介绍4 4类生物反应：酶反应、微生物反应、免疫反应和核酸类生物反应：酶反应、微生物反应、免疫反应和核酸反应，以及生物反应中伴随着发生的物理量变化。反应，以及生物反应中伴随着发生的物理量变化。第11页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 1 1 酶反应基本概念酶反应基本概念 1 1）酶的定义酶的定义 人们对酶的认识在人们对酶的认识在1919世纪产生了飞跃，世纪产生了飞跃，1854185418641864年，年，Pasteur证明发酵作用是由微生物引起的，推翻了证明发酵作用是由微生物引起的，推翻了“自生论自生论”。当时曾提出当时曾提出“活体酵素活体酵素”和和“非活体酵素非活体酵素”的名词。的名词。18771877年，年，Kuhne提出使用提出使用“enzyme”这个词，将酶与微生物这个词，将酶与微生物两者区别开。两者区别开。Liebig等认为发酵不一定要和酵母细胞相联系，而等认为发酵不一定要和酵母细胞相联系，而是由酵母细胞中所分泌的某些化学物质是由酵母细胞中所分泌的某些化学物质(酶酶)所引起的。这一假设所引起的。这一假设于于18971897年被年被Buchner兄弟证实，他们用酵母细胞滤液成功地进行兄弟证实，他们用酵母细胞滤液成功地进行了糖至乙醇和二氧化碳的转化，一般认为，了糖至乙醇和二氧化碳的转化，一般认为，这项实验是酶学研究的这项实验是酶学研究的开始开始。此后近此后近1 1个世纪中，酶学研究获得一系列重要突破。此后，酶的个世纪中，酶学研究获得一系列重要突破。此后，酶的蛋白质属性蛋白质属性和和催化功能催化功能被普遍认识。被普遍认识。第12页，本讲稿共55页第13页，本讲稿共55页3.1 3.1 酶及酶反应酶及酶反应 2 2）酶的蛋白质性质酶的蛋白质性质 酶是蛋白质，这一结论最早由酶是蛋白质，这一结论最早由sumner提出，他在提出，他在19261926年首次从刀豆中年首次从刀豆中提取了脲酶结晶，并证明这个结晶具有蛋白质的一切性质。以后人们又陆续获提取了脲酶结晶，并证明这个结晶具有蛋白质的一切性质。以后人们又陆续获得了多种结晶酶，在已经鉴定的得了多种结晶酶，在已经鉴定的20002000余种酶中，多数已被结晶或纯化，检索余种酶中，多数已被结晶或纯化，检索SIGMASIGMA目录，作为商品出售的酶已经达目录，作为商品出售的酶已经达400400多种。多种。证明酶是蛋白质有证明酶是蛋白质有4点依据：点依据：蛋白质是氨基酸组成的，而酶的水解产物都是氨基酸，即酶是蛋白质是氨基酸组成的，而酶的水解产物都是氨基酸，即酶是由氨基酸组成由氨基酸组成的。的。酶具有蛋白质所具有的酶具有蛋白质所具有的颜色反应颜色反应，如双缩脲反应、茚三酮反应、乙醛酸反应，如双缩脲反应、茚三酮反应、乙醛酸反应等。等。一切能使蛋白质一切能使蛋白质变性的因素变性的因素，如热、酸、碱、紫外线等，同样可以使酶变性，如热、酸、碱、紫外线等，同样可以使酶变性失活。失活。酶同样具有蛋白质所酶同样具有蛋白质所具有的大分子性质具有的大分子性质，如不能透过半透膜，可以电泳，并有，如不能透过半透膜，可以电泳，并有一定等电点。一定等电点。第14页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 3）酶的催化性质酶的催化性质 酶是生物催化剂。新陈代谢是由无数复杂的化学反应组成的，这酶是生物催化剂。新陈代谢是由无数复杂的化学反应组成的，这些反应大都在酶催化的条件下进行。些反应大都在酶催化的条件下进行。与一般催化剂相比较，与一般催化剂相比较，酶催化具有如下特点酶催化具有如下特点。高度专一性高度专一性(specification)，或称特异性。，或称特异性。一般地讲，一种酶只催化一种反应，作用于特定的一般地讲，一种酶只催化一种反应，作用于特定的底物底物或或化学键化学键。因而有因而有“一种酶，一种一种酶，一种(类类)底物底物”之说。之说。催化效率高催化效率高。酶分子的转化数酶分子的转化数(turnover number)为每个酶分子每分钟大约为每个酶分子每分钟大约转化转化10103 3个底物分子个底物分子(不同的酶转化数不一样不同的酶转化数不一样)。检测底物浓度下限。检测底物浓度下限一般为一般为1010-9-91010-6-6mol/L。以分子比为基础，其催化效率是其他催化剂的。以分子比为基础，其催化效率是其他催化剂的10107 710101313倍。倍。第15页，本讲稿共55页 酶催化一般在酶催化一般在温和条件下进行温和条件下进行 由于酶是蛋白质，极端的环境条件由于酶是蛋白质，极端的环境条件(如高温、酸碱如高温、酸碱)容易使酶失容易使酶失活。活。有些酶有些酶(如脱氢酶如脱氢酶)需要辅酶或辅基需要辅酶或辅基 若从酶蛋白分子中除去辅助成分，则酶不表现催化活性。若从酶蛋白分子中除去辅助成分，则酶不表现催化活性。酶在体内的酶在体内的活力常常受多种方式调控活力常常受多种方式调控 包括基因水平调控、反馈调节、激素控制、酶原激活等。包括基因水平调控、反馈调节、激素控制、酶原激活等。酶促反应酶促反应产生的信息变化有多种形式产生的信息变化有多种形式，如热、光、电、离子化学等。如热、光、电、离子化学等。第16页，本讲稿共55页3.1 3.1 酶及酶反应酶及酶反应 4 4）酶的分类与命名酶的分类与命名 按照酶的催化反应类型，将酶分为按照酶的催化反应类型，将酶分为六大类六大类。(1)氧化还原酶类氧化还原酶类(oxidoreductases)催化氧化还原反应，其代表方程式为：催化氧化还原反应，其代表方程式为：式中，式中，A.2H为氢的给体；为氢的给体；B为氢的受体。这类酶包括为氢的受体。这类酶包括氧化酶、过氧化物酶、氧化酶、过氧化物酶、脱氢酶脱氢酶等。等。(2)转移酶类转移酶类(transferases)催化某一化学基团从某一分子到另一分子，其代表方程为：催化某一化学基团从某一分子到另一分子，其代表方程为：式中，式中，B为被转移的基团，如磷酸基、氨基、酰胺基等。这类酶包括为被转移的基团，如磷酸基、氨基、酰胺基等。这类酶包括转氨酶、转转氨酶、转甲基酶甲基酶等。等。第17页，本讲稿共55页3.1 3.1 酶及酶反应酶及酶反应 (3)水解酶类水解酶类(hydrolases)催化各种水解反应，在底物特定的键上引入水的羟基和氢，一般反应式为：包括肽酶(即蛋白酶，水解肽键)、酯酶(水解酯键)、糖苷酶(水解糖苷键)等。(4)裂合酶类裂合酶类(lyases)催化C-C、C-O、C-N或C=S键裂解或缩合，其代表反应式为：如脱羧酶、碳酸酐酶等。第18页，本讲稿共55页 (5)异构酶类异构酶类(isomerases)催化异构化反应，使底物分子内发生重排，一般反应式为：这类酶包括消旋酶(如L-氨基酸转变成D-氨基酸)、变位酶(如葡萄糖-6-磷酸转变为葡萄糖-l-磷酸)等。(6)合成酶类合成酶类(1igases)或称连接酶类，它催化两个分子的连接并与腺苷三磷酸(ATP)的裂解偶联，同时产生腺苷单磷酸(AMP)和焦磷酸(PPi)：如氨基酸激活酶类。第19页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 每一大类酶又可根据作用底物的性质分为若干亚类和次亚每一大类酶又可根据作用底物的性质分为若干亚类和次亚类。类。酶的名称由两部分组成，酶的名称由两部分组成，开头部分是底物开头部分是底物，后面部分表示后面部分表示催化反应类型催化反应类型，再用再用-ase结尾结尾。如催化丙酮酸羟基化生成草酰。如催化丙酮酸羟基化生成草酰乙酸反应的酶称为丙酮酸羧化酶乙酸反应的酶称为丙酮酸羧化酶(pyrurate carboxylase)。也常常使用简化或习惯名称，如淀粉葡萄糖苷酶称为糖化也常常使用简化或习惯名称，如淀粉葡萄糖苷酶称为糖化酶。酶。酶学编号酶学编号(EC number)由由4个数字构成，如脂肪酶个数字构成，如脂肪酶(甘油酯水解酶甘油酯水解酶)的系列编号为的系列编号为“EC 3.1.1.3.”，表示第三大酶，表示第三大酶类类(水解酶水解酶)、第一亚类、第一亚类(水解发生在酯键水解发生在酯键)、第一亚亚类、第一亚亚类(羟羟基酯水解基酯水解)、甘油酯水解酶。、甘油酯水解酶。第20页，本讲稿共55页3.1 3.1 酶及酶反应酶及酶反应 5 5）酶量表示法酶量表示法 在用酶作分析工具时，酶量的表示有几种方法，根据在用酶作分析工具时，酶量的表示有几种方法，根据国际酶学委员会规定，分别定义如下。国际酶学委员会规定，分别定义如下。酶活力酶活力单位用国际单位单位用国际单位(International Unit，IU)表示。一个酶活力单位指在特定条件下表示。一个酶活力单位指在特定条件下(如如25，pH及底物等及底物等其他条件采用最佳条件其他条件采用最佳条件)，在，在1min能转化能转化1mol底物分子的酶底物分子的酶量，单位为量，单位为IU。酶比活力酶比活力(specific activity)指指1mg酶所具有的酶活酶所具有的酶活力。一般用力。一般用IU/mg表示。表示。酶含量酶含量指每克或每毫升酶制剂含有的活力单位数，即指每克或每毫升酶制剂含有的活力单位数，即IU/g或或IU/ml。第21页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 3.2 酶的作用机理酶的作用机理 1 1）降低反应活化能降低反应活化能 一个封闭的反应体系中，反应开始时，反应底物一个封闭的反应体系中，反应开始时，反应底物分子的平均能量水平较低，为初态分子的平均能量水平较低，为初态(initial state，A)，只有少数分子具有比初态更高一些的能量，高出的这一，只有少数分子具有比初态更高一些的能量，高出的这一部分能量称为活化能部分能量称为活化能G1-(energy of activation)使这使这些分子进入活化态些分子进入活化态(或过渡态或过渡态transition state，A*)，才能进行反应，这些活泼的分子称为活化分子。，才能进行反应，这些活泼的分子称为活化分子。反应物中活化分子愈多，反应速度就愈快。反应物中活化分子愈多，反应速度就愈快。活化能的活化能的定义是：在一定温度下，定义是：在一定温度下，1mol底物全部进入活化态底物全部进入活化态所需要的自由能所需要的自由能F(free energy)，单位是，单位是J/mol。酶能够大幅度降低反应所需要的活化能，使活化能降酶能够大幅度降低反应所需要的活化能，使活化能降到到G2，这样，大量的反应物分子就比较容易地越过小，这样，大量的反应物分子就比较容易地越过小的的“能峰能峰”，进入活化态，进入活化态(图图2-1)，从而使反应在常温，从而使反应在常温下极快地进行。与一般催化剂相比，酶催化使活化能下极快地进行。与一般催化剂相比，酶催化使活化能降低幅度更大。降低幅度更大。第22页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 2)结构专一性结构专一性 酶催化的专一性是由酶蛋白分子(特别是分子中的活性部位)结构特性决定的，根据酶对底物专一性程度的不同，大致可分为三种类型。第一种类型的酶专一性较低，能作用于结构类似的一系列底物结构类似的一系列底物。第二种类型的酶仅对一种物质有催化作用，它们对底物的化学键及其两端对底物的化学键及其两端均有绝对要求均有绝对要求。第三种类型的酶具有立体专一性立体专一性，这类酶不仅要求底物有一定的化学结构，而且要求有一定的立体结构。第23页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 3 3）酶的辅助因子酶的辅助因子 许多酶需要辅助因子许多酶需要辅助因子(co-factor)才能行使催化功能。才能行使催化功能。辅助因子包括辅助因子包括金属离子金属离子和和有机化合物有机化合物，它们构成酶的辅酶，它们构成酶的辅酶(co-enzyme)或辅基或辅基(prosthetic group)，与酶蛋白共同组成，与酶蛋白共同组成全酶全酶(holoenzyme)。脱去辅基的酶蛋白不含有催化活性，称。脱去辅基的酶蛋白不含有催化活性，称为脱辅基酶蛋白为脱辅基酶蛋白(apoenzyrme)，有时又称为酶原，有时又称为酶原(proenzyme,zymogen)。辅酶与辅基没有严格的区别，一般地，与辅酶与辅基没有严格的区别，一般地，与酶蛋白松弛结合的辅酶蛋白松弛结合的辅助因子称为助因子称为辅酶辅酶，与酶蛋白牢固结合的辅助因子称为与酶蛋白牢固结合的辅助因子称为辅基辅基。辅助因子通常存在酶的活性中心部位，对酶的催化起重要辅助因子通常存在酶的活性中心部位，对酶的催化起重要作用。作用。第24页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 4)酶的活性中心酶的活性中心 酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的一定区域一定区域，这个区域就是酶的，这个区域就是酶的活性中心活性中心，它往往，它往往位于分子表面的凹穴中位于分子表面的凹穴中。对不需要辅酶的酶来说，活性中心。对不需要辅酶的酶来说，活性中心(active center)就是酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基就是酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基组成。对需要辅酶的酶分子来说，辅酶分子，或辅酶分子上的某一部分结组成。对需要辅酶的酶分子来说，辅酶分子，或辅酶分子上的某一部分结构往往就是活性中心的组成部位。活性中心的各基团与酶分子的其他残基构往往就是活性中心的组成部位。活性中心的各基团与酶分子的其他残基有序地排列，使得这个部位的空间结构恰好适合与底物分子直接紧密接触，有序地排列，使得这个部位的空间结构恰好适合与底物分子直接紧密接触，并具有适宜的非极性微环境，并具有适宜的非极性微环境，以利于基团间发生静电作用以利于基团间发生静电作用。活性中心有两个功能部位活性中心有两个功能部位(或域或域)；结合域结合域(binding domain)和和催催化域化域(catalytic domain)。这种特定的结构才能与一定的底物结合，并催。这种特定的结构才能与一定的底物结合，并催化其发生化学变化。活性中心空间结构的任何细微的改变，都可能影响酶活化其发生化学变化。活性中心空间结构的任何细微的改变，都可能影响酶活性。性。第25页，本讲稿共55页3.1 酶及酶反应酶及酶反应 5)5)酶催化的化学形式酶催化的化学形式 酶催化的化学形式主要包括酶催化的化学形式主要包括共价催化共价催化和和酸碱催化酸碱催化。共价催化共价催化中，酶与底物形成反应活性很高的共价中间物，这个中，酶与底物形成反应活性很高的共价中间物，这个中间物很易变成过渡态中间物很易变成过渡态(transition state)，故反应的活化能大大，故反应的活化能大大降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。酸碱催化酸碱催化广义地指质子供体及质子受体的催化。酶反应中的广义地指质子供体及质子受体的催化。酶反应中的酸碱催化十分重要，发生在细胞内的许多反应都是受酸碱催化的，酸碱催化十分重要，发生在细胞内的许多反应都是受酸碱催化的，如将水加到羰基上、酯类的水解、各种分子重排以及许多取代反如将水加到羰基上、酯类的水解、各种分子重排以及许多取代反应等。应等。酶蛋白中可以起酸碱催化作用的功能团有氨基、羧基、巯酶蛋白中可以起酸碱催化作用的功能团有氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基基、酚羟基及咪唑基等，其中组氨酸的咪唑基既是一个很强的亲核基等，其中组氨酸的咪唑基既是一个很强的亲核基团，又是一个有效的广义酸碱功能基。因此，咪唑基是酶的酸碱催化中团，又是一个有效的广义酸碱功能基。因此，咪唑基是酶的酸碱催化中最活泼的一个催化功能基。最活泼的一个催化功能基。第26页，本讲稿共55页3.2 微生物反应微生物反应 1 微生物反应特点微生物反应特点 微生物反应过程是利用微生物进行生物化学反应过程，即微生物反应过程是利用微生物进行生物化学反应过程，即微生物反应就是将微生物作为生物催化剂进行的反应。酶在微微生物反应就是将微生物作为生物催化剂进行的反应。酶在微生物反应中起最基本的催化作用。生物反应中起最基本的催化作用。微生物反应与酶促反应的共同点：微生物反应与酶促反应的共同点：同属生化反应，都在温和条件下进行；同属生化反应，都在温和条件下进行；凡是酶能催化的反应，微生物也可以催化；凡是酶能催化的反应，微生物也可以催化；催化速度接近，反应动力学模式近似。催化速度接近，反应动力学模式近似。第27页，本讲稿共55页 微生物反应的特殊性：微生物反应的特殊性：微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境，细微生物细胞的膜系统为酶反应提供了天然的适宜环境，细胞可以在相当长的时间内保持一定的催化活性；胞可以在相当长的时间内保持一定的催化活性；在多底物反应时，微生物显然比单纯酶更适宜作催化在多底物反应时，微生物显然比单纯酶更适宜作催化剂；剂；细胞本身能提供酶促反应所需的各种辅助因子和能量；细胞本身能提供酶促反应所需的各种辅助因子和能量；更重要的是，微生物细胞比酶的来源更方便、更廉价。更重要的是，微生物细胞比酶的来源更方便、更廉价。第28页，本讲稿共55页 利用微生物作传感器分子识别元件的不利因素：利用微生物作传感器分子识别元件的不利因素：微生物反应通常伴随细胞的生长或凋亡，不容易建立微生物反应通常伴随细胞的生长或凋亡，不容易建立分析标准；分析标准；细胞是多酶系统，许多代谢途径并存，难以排除不细胞是多酶系统，许多代谢途径并存，难以排除不必要的反应；必要的反应；环境条件变化会引起微生物生理状态的复杂化，不适当的环境条件变化会引起微生物生理状态的复杂化，不适当的操作会导致代谢转换现象，出现不期望有的反应。操作会导致代谢转换现象，出现不期望有的反应。第29页，本讲稿共55页 2 分析微生物学分析微生物学 分析微生物学分析微生物学(analytical microbiology)是利用微生是利用微生物完成定量分析任务的学科。在有些情况下，微生物测定物完成定量分析任务的学科。在有些情况下，微生物测定法比化学方法更专一和灵敏，效率亦更高。法比化学方法更专一和灵敏，效率亦更高。有几种测定的形式，如细胞的增殖，酸、碱类等代谢有几种测定的形式，如细胞的增殖，酸、碱类等代谢产物的生成，呼吸强度，细胞内部亚系统的反应产物的生成，呼吸强度，细胞内部亚系统的反应(如盐类从细如盐类从细胞中渗漏出来胞中渗漏出来)以及物理性态的变化等，其中以及物理性态的变化等，其中以以细胞增殖细胞增殖和和呼吸呼吸法法最为常用最为常用。第30页，本讲稿共55页 细胞增殖法细胞增殖法的原理是，某些微生物必须依赖一些氨基酸、的原理是，某些微生物必须依赖一些氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶等物质生长，当培养液中缺少某一种必维生素、嘌呤和嘧啶等物质生长，当培养液中缺少某一种必需营养时，就限制菌体生长。因此，需营养时，就限制菌体生长。因此，菌体增殖与必需营养物菌体增殖与必需营养物质的浓度成正相关质的浓度成正相关。另一方面，抗生素能抑制菌体生长，。另一方面，抗生素能抑制菌体生长，根据菌体增殖速度可以测定抗生素类的浓度。菌体增殖采根据菌体增殖速度可以测定抗生素类的浓度。菌体增殖采用用平板生长计数法平板生长计数法和和菌悬液浑浊度法菌悬液浑浊度法，测定周期为，测定周期为1天天至数天，灵敏度至数天，灵敏度g/ml级。级。第31页，本讲稿共55页 呼吸法呼吸法是根据菌体在同化底物或被抑制生长时的是根据菌体在同化底物或被抑制生长时的CO2释放或释放或O2的消耗进行测定，通常采用瓦勃测压法，的消耗进行测定，通常采用瓦勃测压法，反应时间为数十分钟至数小时。如制霉菌素能降低酵母反应时间为数十分钟至数小时。如制霉菌素能降低酵母菌的菌的CO2排出量，大肠杆菌能对谷氨酸脱羧并释放足够可检排出量，大肠杆菌能对谷氨酸脱羧并释放足够可检的的CO2等。等。在被分析底物能促进微生物代谢的情况下，关键是要获得在被分析底物能促进微生物代谢的情况下，关键是要获得对底物的专一性反应。实验菌株常常是一些经过变异的菌株，对底物的专一性反应。实验菌株常常是一些经过变异的菌株，它们或成为对某些营养的依赖性称为营养缺陷型，或能在体内它们或成为对某些营养的依赖性称为营养缺陷型，或能在体内高浓度地积累某种酶，由此实现测定的专一性。高浓度地积累某种酶，由此实现测定的专一性。第32页，本讲稿共55页3.3 3.3 免疫学反应免疫学反应 免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力。可区别为自然免免疫指机体对病原生物感染的抵抗能力。可区别为自然免疫和获得性免疫。疫和获得性免疫。自然免疫自然免疫是是非特异性非特异性的，即能抵抗多种病原微生物的损害，的，即能抵抗多种病原微生物的损害，如完整的皮肤、黏膜、吞噬细胞、补体、溶菌酶、干扰素等。如完整的皮肤、黏膜、吞噬细胞、补体、溶菌酶、干扰素等。获得性免疫获得性免疫一般是一般是特异性特异性的，在微生物等抗原物质刺的，在微生物等抗原物质刺激后才形成激后才形成(免疫球蛋白等免疫球蛋白等)，并能与该抗原起特异性反应。，并能与该抗原起特异性反应。上述各种免疫过程中，抗原与抗体的反应是最基本的反应。上述各种免疫过程中，抗原与抗体的反应是最基本的反应。第33页，本讲稿共55页3.3 3.3 免疫学反应免疫学反应 1 抗原 1）抗原的定义 抗原(antigen)是能够刺激动物机体产生免疫反应的物质，但从广义的生物学观点看，凡是具有引起免疫反应性能的物质，都可以称为抗原。抗原有两种性能：刺激机体产生免疫应答反应刺激机体产生免疫应答反应；与相应免与相应免疫反应产物发生特异性结合反应疫反应产物发生特异性结合反应。前一种性能称为免疫原性免疫原性(immunogenicity)，后一种性能称为反应原性反应原性(reactionogenicity)。具有免疫原性的抗原是完全抗原(complete antigen,Ag)，只有反应原性，不刺激免疫应答反应的称为半抗原(hapten)。第34页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应第35页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应 3）抗原的理化性状 (1)物理性状物理性状 完全抗原的分子质量较大，通常在104D以上。分子质量越大，其表面积相应越大，接触免疫系统细胞的机会增多，因而免疫原性也就增强。相对分子质量低于500010000就无免疫原性，如半抗原雌酮-3-葡萄糖苷酸的相对分子质量只有468。抗原均具有一定的分子构型，或为直线直线或为立体构型立体构型。一般认为环状构型比直线排列的分子免疫原性强，聚合态分子比单体分子的强。(2)化学组成化学组成 自然界中绝大多数抗原都是蛋白质，既可为纯蛋白质，也可为结合蛋白质，后者包括脂蛋白、核蛋白、糖蛋白等。此外还有血清蛋白、病毒结构蛋白、微生物蛋白及其多糖、脂多糖(细菌内毒素)、植物蛋白和酶类。近年来证明核酸也有抗原性。第36页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应 4）抗原决定簇 抗原决定簇(antigen determinant)是抗原分子表面的特殊化学基团，抗原的特异性取决于抗原决定簇的性质、数目和空间排列。抗原的特异性取决于抗原决定簇的性质、数目和空间排列。不同种系的动物血清白蛋白因其末端氨基酸排列的不同，而表现出各自的种属特异性(表2-2)。一种抗原常具有一个以上的抗原决定簇，如牛血清蛋白有14个，甲状腺球蛋白有40个。第37页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应 2 抗体 抗体(antibody)是由抗原刺激机体产生的具有特异性免疫功能的球蛋白，又称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。人类免疫球蛋白有五类，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白都是由一个至几个单体组成。每一个单体有两条相同的分子质量较大的重链(heavy chain,H链)和两条相同分子质量的较小的轻链(light chain，L链)组成，链与链之间通过二硫链(-S-S-)及非共价链相连接(图2-6)。CH1CH2CH3VHVLCL第38页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应 每条重链的分子质量为每条重链的分子质量为55000D，由，由420460个氨基酸组成。各种个氨基酸组成。各种Ig重链的氨基酸组成不同，重链的氨基酸组成不同，因而抗原性亦各异，可分为因而抗原性亦各异，可分为、及及，分别，分别构成构成IgA、IgG、IgM、IgD和和IgE。一条重链可。一条重链可分为四个功能区，每一功能区约含分为四个功能区，每一功能区约含110个氨基酸，个氨基酸，N端的功能区是重链的可变区端的功能区是重链的可变区(VH)，其余为重链的恒，其余为重链的恒定区定区(CH)，分别称为，分别称为CH1、CH2和和CH3。轻链分子质量为轻链分子质量为22000D，由，由213216个氨个氨基酸组成。每条轻链分为两个功能区，基酸组成。每条轻链分为两个功能区，N端为轻链端为轻链可变区可变区(VL)，约含，约含109个氨基酸余下部分为恒定个氨基酸余下部分为恒定区区(CL)。轻链有两种类型，每一种。轻链有两种类型，每一种Ig只能含一只能含一种类型的轻链，即或为种类型的轻链，即或为H型，或为型，或为型。型。在在VL区和区和VH区都发现了更易变化的区域，区都发现了更易变化的区域，称其为高变区。称其为高变区。高变区是抗体结合抗原的高度特异高变区是抗体结合抗原的高度特异性所在，而变化区其他部分主要功能是为高变区提性所在，而变化区其他部分主要功能是为高变区提供合适的三维空间结构，以使抗原分子有一合适的供合适的三维空间结构，以使抗原分子有一合适的浅槽。浅槽。CH1CH2CH3VHVLCL第39页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应 3 3 抗原抗原-抗体反应抗体反应 抗原抗原-抗体结合时将发生抗体结合时将发生凝聚凝聚、沉淀沉淀、溶解溶解反应和促进吞噬抗原颗粒反应和促进吞噬抗原颗粒的作用。的作用。抗体与抗原的特异性结合点位于抗体与抗原的特异性结合点位于Fab L链及链及H链的高变区链的高变区，又称，又称抗体活性抗体活性中心中心，其构型取决于抗原决定簇的空间位置，两者可形成互补性构型。，其构型取决于抗原决定簇的空间位置，两者可形成互补性构型。在溶液中，抗原和抗体两个分子的表面电荷与介质中离子形成双在溶液中，抗原和抗体两个分子的表面电荷与介质中离子形成双层离子云，内层和外层之间的电荷密度差形成层离子云，内层和外层之间的电荷密度差形成静电位静电位和和分子间引力分子间引力。由。由于这种引力仅在近距离上发生作用，抗原与抗体分子结合时对位应十分准确。于这种引力仅在近距离上发生作用，抗原与抗体分子结合时对位应十分准确。第40页，本讲稿共55页 这种准确对位是由于两个条件所致，一是结合部位的形状要互补于抗原的形状；一是结合部位的形状要互补于抗原的形状；二是抗体活性中心带有与抗原决定簇相反的电荷二是抗体活性中心带有与抗原决定簇相反的电荷。然而，抗体的特异性是相对的，表现在两个方面：其一，部分抗体不完全与抗原决定簇相对应。如鸡白蛋白的抗体可与其他鸟类白蛋白发生反应，这种现象称为交叉反应(cross reaction)，交叉反应与同源性抗原反应有显著差异；其二，即便是针对某一种半抗原的抗体，其化学结构也可能不一致。第41页，本讲稿共55页 抗原与抗体结合尽管是稳固的，但也可能是可逆的。调节溶液的pH或离子强度，可以促进可逆反应。某些酶能促使逆反应，抗原-抗体复合物解离时，都保持自己本来的特性。例如，用生理盐水把毒素-抗毒素的中性混合物稀释至原浓度的l时，所得到的液体仍有毒性，说明复合物发生解离，该复合物能在体内解离而导致中毒。第42页，本讲稿共55页3.33.3免疫学反应免疫学反应 4 免疫学分析 1）沉淀法沉淀法 可溶性抗体与其相应的抗原在液相中相互接触，可形成不溶性抗原-抗体复合物而发生沉淀，包括扩散实验和电泳试验，此为经典的免疫学实验，灵敏度水平为pg/ml级。2）放射免疫测定法放射免疫测定法(radiation immunoassay,RIA)利用放射性同位素示踪技术和免疫化学技术结合起来的方法，具有灵敏度高、特异性强、准确度佳、重复性好等特点，可检出10-1210-9g痕量物质。经典的RIA用已知浓度的标记(14C，32P，35S，3H等)抗原和样品抗原竞争限量的抗体，曾经广泛应用，缺点是要使用同位素，对操作者和环境有一定的危害性。第43页，本讲稿共55页 3）免疫荧光测定法免疫荧光测定法 将抗体(或抗原)标记上荧光素与相应的抗原(或抗体)结合后，在荧光显微镜下呈现特异性荧光，称为免疫荧光法(immuno fluorescent assay)。最常用的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。FITC有两种异构体，都能与蛋白良好地结合，其最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。免疫荧光法不仅具有高度的特异性和敏感性，而且能对组织或细胞样品中的微量抗原或微量抗体进行定位，