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中药化学实验指导书 中药教学部 重庆邮电学院生物信息学院 2005 年 02 月 前言 中药化学是一门运用现代化学理论和方法研究中药化学成分的学科，近年来发展迅速，逐步渗透到中药鉴定、中药制剂、中药炮制等学科中，在药物的研制、中药资源的开发、药品检验、中药生产过程中有广泛的应用。另一方面，中药化学是中药的基础研究，是中药现代化工作中十分重要的组成部分。同时，中药化学是中药专业的专业课程，其基本实验技能的培养是本课程的重要组成部分，通过中药化学实验，培养学生的动手操作能力，为学生在中药鉴定、中药分析、制剂分析等专业课上打下坚实的专业基础。为此，我们根据本课程教学大纲的要求，组织编写了本实验讲义。生物信息学院中药学教学部 高运玲 潘正编著 二 OO 五年二月目 录 第一节 实验注意事项01 第二节 试剂的使用04 第三节 实验部分06 实验一 层 析 练 习 0 6 实验二 大黄中游离蒽醌的提取、分离与检识10 实验三 秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离和鉴定13 实验四 芦丁的提取和鉴定 15 实验五 葛根中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定20 实验六 茴香醚的提取分离和检识23 实验七 三七总皂甙的提取和精制25 实验八 薯蓣皂甙元的提取分离与鉴定27 实验九 盐酸小檗碱的提取、精制及检识 30 实验十 掌叶防已碱的提取分离及延胡索乙素的制备 34 实验十一 苦参生物碱的提取、分离与鉴定 39 实验十二 中药化学成分的系统预试验43 附 录 53-1-第一节 实验注意事项 一、教学目的 通过中药化学的实验教学，要求学生能够：1、掌握化学实验中常用的煎煮法、渗漉法、回流法、液液萃取法等中药提取法的操作技术。2、掌握薄层层析、纸层析的基本操作，熟悉它们在中药化学成分鉴定、提取、分离和检识中的应用。3、训练常量、半微量成分的分离，精制及检识方法，并了解有关中药成分研究中的文献检索和工具书查阅的基本方法。4、初步形成方法自我设计中药中主要有效成分提取的能力，培养独立分析问题、解决问题的能力。二、中药化学实验的特点 1、实验周期长。一般一个提取实验需要用去 35 次课的时间，其间相隔数天。因此，在实验过程中，应该注意仪器、试剂尤其是提取物的妥善保管或者保存。2、所用溶剂和试剂品种多，而且用量较大。3、许多有机溶剂易燃、有毒，或有腐蚀性。个别甚至容易发生爆炸。4、也有不少实验需要电炉加热或者抽气机减压，学生用到的热源和电器较多，安全教育要跟上。严防产生中毒、触电、烫伤等意外，谨防火灾、爆炸等重大事故的发生。三、实验室规则 1、必须遵守实验室的各项制度，听从教师指导，尊重实验室工作人员的职权，实验前应认真预习，明确目的、要求，弄清操作步骤、方法和基本原理。作好计划，做到心中有数。在未弄清实验目的及-2-每一实验步骤之前，切勿开始作任何实验。2、实验时要做到整齐、清洁。保持桌面、仪器、水槽、地面四洁。任何固体物质不能投入水槽中，废纸、废屑应投入废纸箱内，废溶液应倒入废液缸内，勿倒可燃或易挥发性溶媒，于水槽或缸内。3、对公用仪器和试剂（如打孔机、显色剂等）要在指定地点使用，并保持整洁，不能任意挪动。4、实验进行时不能擅自离开，要认真做好实验记录。实验室内严禁吸烟。5、实验完毕离开实验室时，应打扫实验室，检查水、电，关好窗门。四、实验室安全守则 在中药化学实验中，常使用甲醇、乙醇、乙醚、石油醚等易挥发、易燃烧，有毒的有机溶剂及易碎的玻璃仪器，若操作不慎，很容易发生事故，常见事故有“火灾”、“爆炸”、“外伤”、“中毒”等，为防止事故的发生，必须随时注意以下几点：1、实验开始应检查仪器是否完整无损，装置是否正规。回流、蒸馏时，冷凝水是否通畅，干燥管是否阻塞不通。若在常压下选行蒸馏或回流，仪器装置必须与大气相遇，不能密闭。（如密闭加热而导致的容器内压力增加，会引起装置爆裂，特别是使用明火时，装置中的可燃液体就会着火）2、回流或蒸馏低沸点易燃液体时，瓶内的液重只能装三分之二，不能使用明火加热，最好使用水浴或电热套。液内要放几颗沸石或素烧瓷片，防止过热冲瓶或暴沸。若在加热后发现未加入沸石，绝不能立即揭开瓶盖补放，而应停止加热，液体冷却后才能加入，加热途中也不得加入活性炭脱色，否则也会发生暴沸。减压蒸馏使用玻璃仪器，质量要好，最好用圆底烧瓶，防止因机械强度不够，引起爆炸。3、蒸馏、回流易燃，易挥发，有毒液体时，仪器装置切勿漏气，冷凝管流出液应用弯接管导至接受瓶中，余气应用橡皮管通往室外或水槽里。4、加压柱层析时,层析柱及储液瓶机械性能要高、连接处要牢，并注意控制压力，以防炸裂装置。-3-5、使用电气设备（如电烘箱、电冰箱、真空泵、离心机等）及各种分析仪器时一定要弄清电路及操作规程，不懂就问，切勿自作主张。实验室一旦发生火灾事故时，应保持镇静，切勿惊慌失措，应立即采取各种相应措施，以减少事故损失。首先，要立即断绝火源（如电源、煤油炉、煤气等）,并移开附近的易燃物质。少量溶剂（几个ml）着火，可任其烧完。三角瓶内溶剂着火可用石棉网或湿布盖熄。小火可用湿布或黄沙盖熄。火较大时应根据具体情况采用下列灭火器材。泡沫灭火器：内部分别装有碳酸氢钠溶液和硫酸铝溶液，使用时将筒颠倒，两种溶液立即反应生成硫酸氢钠、氢氧化铝及大量的二氧化碳。灭火器筒内压力突然增大，大量二氧化碳泡沫喷出，即可灭火。四氯化碳灭火器：用以扑灭电器或电器附近之火，但不能在狭小和通风不良的实验室中应用，因为四氯化碳在高温时要生成剧毒的光气，此外，四氯化碳和金属钠接触也要发生爆炸。使用时须连续抽动唧筒，四氯化碳即会由喷咀喷出，遇热变为气体，此气体比重比空气大，能沉下来把火焰包围住，将火扑灭。二氧化碳灭火器：是实验室中最常用的一种灭火器，它的钢筋内装有压缩的液态二氧化碳，使用时打开开关，二氧化碳气体即会喷出，用以扑灭有机物及电器设备的着火使用时应注意，一手提灭火器，一手应握在喷二氧化碳嗽叭筒的把手上。因喷出的二氧化碳压力骤然降低，温度也骤降，手若把在嗽叭筒上易被冻伤。无论用何种灭火器，皆应从火的四周开始向中心扑灭。油浴，和有机溶剂着火时绝不能用水浇，因为这样反而会使火焰蔓延开来。若衣服着火，切勿奔跑，赶快脱下衣服或用厚的外衣包裹致熄。较严重者应躺在地上（以免火焰烧向头部）用防火毯紧紧包住，直至火熄，或打开附近的自来水开关用水冲淋熄灭。-4-五、急救常识 1、玻璃割伤 玻璃割伤是常见的事故，如为一般轻伤，应及时挤出污血，用消毒过的镊子取出玻璃碎片，用蒸馏水洗涤伤口，涂上红药水和碘酒后包扎好。如为大伤口，应立即用绷带扎紧伤口上部，使伤口停止出血，急送医院。2、火伤 轻伤涂甘油或硼酸凡士林，重伤送医院。3、试剂灼伤 酸液或碱液灼伤皮肤时，伤处首先用大量水冲洗。若为酸液灼伤，再用5%碳酸氢钠溶液洗涤；若为碱液灼伤，再用1%醋酸洗，最后用水洗，再涂上油膏凡士林。酸液或碱液溅入眼睛中时，抹去溅在眼睛外面的酸液或碱液，立即用大量水冲洗。若为酸液，再用1%碳酸氢钠溶液冲洗；若为碱液，再用1%硼酸溶液冲洗，最后用水冲洗，滴入蓖麻油。酸液或碱液洒在衣服上，先用水冲洗。若为酸液再用稀氨水洗。若为碱液，再用1%醋酸溶液洗涤，然后用氢氧化铵中和多余的醋酸，最后用水洗涤。酸液洒在地板上，先撒石灰粉，再用水冲洗。上述各种急救法，仅为暂时减轻疼痛的措施。若伤势过重，在急救之后应速送医院。-5-第二节 试剂的使用 化学试剂分为无机化学试剂和有机化学试剂两大类。根据用途不同又分通用试剂和专用试剂。我国生产的有机化学试剂已有百万余种。无机化学试剂有数十万种，并且正与日俱增。我国关于试剂的标准有国家标准（GB），化学工业部标准（HG）,化学工业部暂行标准（HGB）以及地方企业标准和厂订标准。根据我们国家的标准，按试剂所含杂质的多少，将试剂分成优级纯、分析纯、化学纯、实验试剂四级。优级纯杂质含量最少，又称保证试剂（符号 GR）为一级品，适用于精密的分析工作和科研工作。分析纯的杂质比优级纯稍多，又称分析试剂（符号 AR）为二级品，适用一般的分析工作、分离鉴定工作和科研工作。化学纯（符号 CP）杂质较多，为三级品，适用一般的提取、分离工作及学生实验的一般工作。实验试剂（符号 LR）杂质多，为四级品，用作粗提工作和实验中的辅助试剂。除这四个等级之外，对于专用试剂还有光谱纯试剂，基准试剂、色谱纯试剂等。光谱试剂（符号 SP）的杂质的含量用光谱法已测不出或者杂质的含量低于某一限度，这种试剂主要用来作为光谱分析中的标准物质。基准试剂的纯度相当于或高于保证试剂，用来配制标准溶液，作为容量分析中基准物。色谱纯试剂用来作为色谱分祈中展开剂。按照我国化工部标准规定，我国优级纯试剂用绿色标签作为标记；分析纯用红色标签；化学纯用蓝色标签。在中药化学提取、分离、鉴定实验中，要注意选择纯度相当的试剂，能用低纯度的试剂，绝不要用高纯度试剂，高纯度试剂的制备是复杂的，它们的价格昂贵，要克服任何情况下都采用高纯度试剂的不良习惯。另外如用高纯度试剂，实验用的水、操作器皿也要配合。若选用 GR 级试剂要用重蒸溜水，所用器皿不能有任何杂质自器皿上溶解到溶液中。在使用化学试剂时除了解它的纯度外，必须了解它的物理性能，试剂的物理性能主要指熔点、沸点、比重、折光率、溶解度、易燃性、毒性及外形等数据。这些特性一般在试剂的标签上都有注明。-6-使用试剂的注意事项如下。1、使用易燃、易爆、有毒的试剂时，要特别注意安全，每次按需要量从原包装容器中取出（固体试剂）或倾出（液体试剂）。试剂称量必须在清洁而干燥的器皿内进行。所取的试剂若有剩余，不得倒回原包装容器内，可放适当带盖的小容器中，并用标签注明。2、取固体试剂应使用玻璃、瓷或铂制药铲，严禁用刀子或钢铲取强碱性或酸性试剂。取液体试剂用清洁干燥的移液管，需要长时期使用若干液体试剂，最好每种试剂有专用移液管。取有毒液体或浓酸、浓碱时，绝不许用移液管以口吸的方式取出，应利用真空吸取或带有橡皮气球的移液管吸取或利用量筒取。在开启试剂的瓶塞之后，应将塞子放于清洁的地方或倒放。3、使用有毒物质、易挥发的有毒液体，以及易挥发的强酸、氨，应在排气通风橱内进行，应戴有护目镜及橡皮手套。存放这类试剂时，应远离火源，并封闭于铁柜中。4、易吸水的试剂，不得开口存放，取出试剂后，应立即盖好塞子，必要时用石蜡熔封。见光发生变化的试剂应放棕色瓶内，置于暗处。在空气中能自燃的试剂应保存在盛有适当液体的密闭器中（如金属钠、钾放煤油中，黄磷放水中）。-7-第三节 实验部分 实验一 层析练习 层析法又称色谱法，色层法或层离法。它是近几十年迅速发展起来的一种分离方法，具有设备简单、分离效果好、快速等优点，在许多领域中都得到广泛应用。我们在对中草药进行分析研究时，层析法越来越成为必不可少的、基本的研究手段，因此我们必须熟练地掌握层析法。层析法按操作形式的不同可分为：薄层层析（TLC），纸层析（PC）和柱层析（CC）。一、常用薄层板的制备（一）实验原理 羧甲基纤维素钠(CMCNa)和石膏(Gypsum,简称 G)均为制备层析板常用之粘合剂，前者为一大分子有机化合物，可溶于水，借助其分子间的作用力而起到粘结作用，使吸附剂在一玻璃片上成一坚固的薄层。后者则是利用熟石膏吸水后凝固的性质而使吸附剂粘结为一均匀、结实的薄层。（二）实验内容 1、硅胶羧甲基纤维素钠（CMC-Na）粘合板的制备：称取 CMCNa 0.8 克,溶于 100 毫升蒸馏水中,加热并充分搅拌至全溶。取上述溶液 37 毫升置研钵中,加入薄层层析用硅胶（200 目以上）15 克，研磨成匀浆，用药勺取一定量倒在薄板上并涂布均匀，然后轻轻振动，使薄层面平整均匀，平放，待阴干后，于烘箱中 110烘半小时，进行活化，活化后的薄层置干燥器中备用。2、硅胶 G 粘合板的制备：称取硅胶G 5 克，加蒸馏水 15 毫升，研磨均匀后，取三分之一倾注在予先洗净晾干的玻璃板上，迅速振动玻璃板，使吸附剂薄层均匀平整，阴干后同上活化备用。注意：操作要迅速，以免因石膏吸水凝固而影响薄层的均匀性。3、硅胶的活度测定：-8-3.1 硅胶活度的测定：一般选用三种染料以薄层层析法进行。染料试样配方：二甲基黄、苏丹红、靛酚蓝各取 40mg 混溶于 100ml 苯中即可。操作：将上述混合液点于待测的硅胶 G 或硅胶 CMCN薄层上，以苯为展开剂，展开 10cm（约 20mins），三种染料应明显分离。如果靛酚蓝的色斑接近于起始线，二甲基黄的色斑位于薄层的中间，苏丹红的色斑在靛酚蓝与二甲基黄的色斑之间，则可认为薄层板的活性符合通常使用的薄层要求。3.2 硅胶活度的毛细管测定法：操作：取 1.075cm 毛细管一支，将毛细管一端灼烧加热封闭。取1 个用于试剂瓶的滴帽，使吸附剂进入毛细管内，除去滴帽即可，（或采用测熔点法加入吸附剂）。再用吸管吸 1 滴苯在毛细管开口端（其目的是为了防止吸附剂从毛细管中掉下），切去毛细管的封闭端，从已被苯浸润的一端蘸取微量的 0.5%的染料苯溶液。然后将毛细管放入盛有几毫升苯的容器中，展开，计算 R值，从下表中查出吸附剂的活度级别。硅胶活度与 Rf 值的关系 吸附剂 含水量%Rf 值 级别 硅胶 0 0.15 I 3 0.22 6 0.33 9 0.44 12 0.55 I 15 0.65 II 二、纸层析练习（）实验原理 纸层祈又叫分配纸层析（PC），是利用滤纸本身吸附的水分作固定相，所选用的展开剂作为流动相，根据不同极性化合物在该两相中的分配系数不同，随着展开剂的不断移动，而将各化合物分离开。-9-（二）实验内容 1、点样：取 153 厘米中速新华滤纸一张，在距一端 2 厘米处用铅笔轻轻划一横线，作为起始线，在间隔 1 厘米处分别点上以下样品：1%D葡萄糖水液 1%L鼠李糖水液。展开剂：正丁醇醋酸水（4:1:5，上层）显色剂：苯胺邻苯二甲酸试剂喷后于105110烤10分钟，糖显深浅不同的棕色斑点。支持剂：新华层析滤纸（中速,207cm）2、样 品：板蓝根注射液或 10%的板蓝根配成 5%乙醇溶液 对照品：精氨酸、亮氨酸、脯氨酸 1%的水溶液 展开剂：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：1 或者 4：1：5 的上层液）显色剂：0.2%茚三酮乙醇溶液 操 作：取新华层析滤纸条，在距底边23cm处用铅笔画一条直线。并做四个等分点分别用毛细管点上适量样品或对照品溶液，待溶剂挥干后（可用电吹风吹干），将滤纸用细棉线悬吊在盛有展开剂的层析缸中，使滤纸下端与展开剂接触，上行法展开，至展开剂前沿离起始线15cm左右时取出，并用铅笔画下前沿位置。热风吹去其上展开剂后，喷显色剂，再加热至100左右显色。如需长期保存，此时可再喷2%硫酸镍水溶液固色。计算精氨酸、脯氨酸和亮氨酸的R值。三、硅胶柱层析练习（）实验原理 柱层析是中草药有效成分研究中的一种常用分离方法。许多结构相似而不能用一般的萃取，重结晶等方法分离的中草药成分，通过选择一定的吸附剂和洗脱剂，采用柱层析法均可得到满意的分离效果。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺、活性炭、淀粉硅藻土等，根据不同的化合物而选用不同-10-的吸附剂。本实验利用叶色素在硅胶柱上有不同的保留值，故其在柱上的迁移速率不同，选用层析用硅胶（100-140目）作吸附剂，利用干柱层析，对叶绿素等色素类成分进行分离，效果良好。叶色素中含有-胡萝卜素、脱镁叶绿色素、叶黄素、叶绿素A、叶绿素B等化合物。利用硅胶干柱，选用适宜的洗脱剂，可使各组分分次流出。通过对各流出组分进行层析，合并，回收溶剂，而得到不同的叶色素部分。（二）实验内容 1、装置与条件：层析柱：玻璃柱 样 品：植物叶 吸附剂：层析硅胶 100-140目 洗脱剂：环己烷-乙酸乙酯 检 识：硅胶 G-CMC 板，展开剂同洗脱剂。显 色：紫外光下观察 2、装柱：常用装柱方法有两种，即干法和湿法，可根据不同情况选用。本实验采用干法装柱。（1）柱的选择和予处理：根据被分离样品的量及吸附剂的种类，选取一定大小的层析柱，用常水、去污粉、常水、蒸馏水依次洗刷干净，使管壁不挂水珠，晾干备用。检查磨口号码是否对号，而后在转动活塞处涂少许凡士林，底部塞入松紧适宜的棉花，顶部装上 100毫升分液漏斗。（2）装柱：称取 l00140目层析硅胶 20克，通过玻璃漏斗倒入柱中，用两个橡皮塞轻轻对称敲击层析柱或将下口接抽气泵抽气，使吸附剂实而匀，上部平整。（3）加样：称取植物叶 5克，溶于 10毫升石油醚或乙酸乙酯中，碾磨至色素溶解。加入柱的上端，压上少量脱脂棉。将装有流脱剂的分液漏斗通过橡皮塞固定在柱的顶端，柱的出口处放一三角烧瓶进行收集。-11-3、洗脱与收集：先打开柱的下端活塞，再开启分液漏斗活塞，使洗脱剂流入柱中，向下浸润。在整个浸润和洗脱过程中，栓顶液面必须高于吸附剂顶端 1 厘米以上。从开始洗脱到洗脱液流出，约需 0.5小时。用试管收集，每份 10 毫升，共收集 15 份，标明序号，薄层检识。流速控制 12 毫升分。4、检识与合并：在 1010 厘米硅胶 G 板的端 1.5厘米处用铅笔轻轻划一横线，每间隔 1 厘米处作一标记，下面标明序号。将收集的各流分和标准品按序在薄板上点祥。若洗脱液浓度太稀，可反复点样（每次点样后必须使溶剂挥干，才能再重复点）。直至能在紫外灯下观察到明显荧光斑点即可。然后放入盛有展开剂的标本缸内进行展开至一定距离，将其取出，挥干溶剂，首先在紫外灯下观察荧光，标出荧光位置与颜色，记录结果，合并相同流分。四、氧化铝柱层析练习 1、装置与条件：层析柱：玻璃柱 样 品：0.5M FeCl3、CuCl2、Co(NO3)2混合液0.5ml 吸附剂：层析用中性氧化铝 洗脱剂：水 2、装柱：本实验采用干法装柱。（1）柱的选择和予处理：（2）装柱：（3）加样：3、洗脱与收集：4、结果：Fe3+棕色层、Cu2+浅蓝色层、Co2+淡紫色层-12-实验二 大黄中游离蒽醌的提取、分离与检识 大黄为泻下、健胃、清热、解毒的常用中药，品种繁多，质优者为寥科植物掌叶大黄（Rheum Palmatum L.），药用大黄（R.offIcinale Beill）和唐古特大黄（R.tanguticum Maxim.ex Balf）的根及根茎。大黄中含有多种羟基蒽醌类化合物，它们在植物中主要以甙的形式存在，总含量为 2 5%，大黄中主要的羟基蒽醌类化合物有大黄酚(1)、大黄素(2)、大黄酸(3)、大黄素甲醚(4)、芦荟大黄素(5)及其甙类。OHOOHR2OR1R1 R2H CH3OH CH3H COOHOCH3 CH3H CH2OH大黄酚大黄素大黄酸大黄素甲醚芦荟大黄素 大黄酚（Chrysophanol）为金黄色片状结晶（乙醇或苯），mp.196-197，能升华，可溶于丙酮、乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、热苯和氢氧化钠水溶液，微溶于石油醚、乙醚，不溶于水、碳酸钠和碳酸氢钠水溶液。大黄素（Emodin）为橙黄色针状结晶（乙醇或冰醋酸），mp.256257，能升华，易溶于稀氨水、碳酸钠和氢氧化钠水溶液，可溶于乙醇、丙酮，在乙醚、氯仿、苯、四氯化碳、二硫化碳等溶剂中溶解度较小，几乎不溶于水。大黄酸（Rheine）为黄色针状结晶（升华法），mp.321322，330分解，易溶于碱水液、吡啶，微溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯、石油醚。几乎不溶于水。大黄素甲醚（Physcion）砖红色针状结晶（苯），mp.203-207，能升华，溶解性质与大黄酚相-13-似。芦荟大黄素（Aioeemodin）为橙黄色针状结晶（甲苯），mp.223-224，能升华，可溶于乙醚、热乙醇、苯、稀氨水、碳酸钠和氢氧化钠水溶液。羟基蒽醌甙有大黄素甲醚葡萄糖甙，大黄素葡萄甙，大黄酸葡萄糖甙,大黄酚葡萄糖甙，大黄素-1-O-B-D-葡萄糖甙，芦荟大黄素-O-B-D-葡萄糖甙。一、实验目的 1.掌握 PH 梯度萃取法分离酸性成分的原理及操作技术。2.掌握羟基蒽醌类成分的主要检识反应及薄层层析检识方法。3.学习从大黄中提取分离羟基蒽醌类成分的方法。二、实验原理 根据大黄中羟基蒽醌类成分可溶于热乙醇中，故用乙醇为溶剂加热回流提取总蒽醌类成分，再利用羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，采用 pH 梯度萃取法分离，可得到各单一成分。三、实验内容 1.乙醇总提取物的制备 取大黄粗粉 150g,置于 1000ml 的园底烧瓶中，加乙醇回流提取三次，第一次加 95%乙醇 500m1,回流一小时，第二次加 95%乙醇 300 ml，加流半小时，第三次加 95%乙醇250 ml，回流半小时，趁热过滤，合并三次乙醇提取液，放置后，如有沉淀可再过滤一次；滤液减压回收乙醇至糖浆状，即为乙醇总提取物；趁热转移至 250ml 的三角烧瓶中备用。2.总游离蒽醌的提取 在盛有乙醇总提取物的三角烧瓶中，加入乙醚 100ml，冷浸半小时，不断振摇，然后静置，将上层乙醚液倾出，置另一500ml 三角烧瓶中，瓶内糖浆状物再同法提取 45 次，每次加乙醚 50ml 及-14-丙酮2ml,至乙自醚液颜色较浅为止，合并乙醚速提取液（注意把水层分离干净），即为含总游离蒽醌的部分，剩余物中则含有蒽醌甙类成分。3.游离蒽醌的分离(1)强酸性部分的分离：将上述乙醚提取液转移至 500ml 的分液漏斗中，加5%碳酸氢钠水溶液（先用 pH 试纸测定其 pH 值）萃取三次，每次加5%碳酸氢钠水溶液40m1（注意萃取时放置分层的时间应稍长些，以免萃取效果不好）。合并三次碳酸氢钠萃取液，在搅拌下小心滴加浓盐酸调至 pH2（观察萃取，酸化时溶液的颜色变化），放置沉淀，过滤，沉淀用水洗至近中性，干燥，称重_g，即为强酸性部分，主要含大黄酸，留作鉴定用。(2)中等酸性部分的分离：将上述经碳酸氢钠萃取过的乙醚液用 5%碳酸钠水溶液（先用 pH 试纸测定其 pH 值）萃取 56 次，每次加 5%碳酸钠水溶液 40 ml，至萃取碱液层颜色较浅为止。合并碳酸钠萃取液，在搅拌下小心滴加浓盐酸调至 pH2，放置沉淀，过滤，沉淀用水洗至近中性，干燥，称重_g，即为中等酸性部分，主要含大黄素，留作鉴定用。(3)弱酸性部分的分离：将上述经碳酸钠萃取过的乙醚液用 2%氢氧化钠水溶液（先用 pH 试纸测定其 pH 值）萃取 34 次，每次加 2%氢氧化钠水溶液 20m1.合并氢氧化钠萃取液，在搅拌下小心滴加浓盐酸调至 pH2,放置沉淀，过滤，沉淀用水洗至近中性，干燥，称重_g，即为弱酸性部分，主要含大黄酚和大黄素甲醚，留作鉴定用。4.蒽醌类成分的检识(1)碱液试验：取上述分离所得游离蒽醌类化合物结晶各 5mg 置于小试管中，加 95%乙醇1ml 溶解，再加 10%氢氧化钠水溶液23滴，观察溶液颜色变化。凡具有邻、对位酚羟基的蒽醌类化合物应呈紫-蓝色，其它羟基蒽醌类化合物多为红色。(2)醋酸镁试验：取上述分离所得游离蒽醌类化合物结晶各 5mg 置于小试管中，加 95%乙醇-15-1m1 溶解，再满加0.5%醋酸镁乙醇液 23 滴，观察溶液颜色变化。凡具有-羟基的蒽醌类化合物应呈橙红色，具有间位二羟基的蒽醌昆类化合物应呈橙-红色，具有对 位二羟基的蒽醌类化合物应呈紫-红紫色，具有邻位二羟基的蒽醌类化合物应呈蓝紫色。5.蒽醌类成分的薄层层检识 吸附剂：硅胶 CMC-Na 硬板，于 110 烘半小时。样 品：a.强酸性部分结晶丙酮溶液 b.大黄酸标准品丙酮溶液 c.中等酸性部分结晶丙酮溶液 d.大黄素标准品丙酮溶液 e.弱酸性部分结晶丙酮溶液 f.大黄酚及大黄素丙酮溶液 展开剂：(1)苯-乙酸乙酯（8：2）(2)苯-甲醇（8：1）(3)石油醚（3060）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）显色剂：先在日光和紫外光灯（365nm）下检视,为橙黄色荧光斑点，再置于氨气中熏后日光下检视，斑点变为红色。-16-实验三 秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离和鉴定 秦皮为本樨科白蜡树属植物白蜡树（Fraxinus Chinensis Poxb）或苦沥白蜡树（F.rhynchophylla Hance）或小叶白蜡树（F.bungeana DC）的树皮,味苦，性微寒。具有清热、燥湿、收涩作用。主治温热痢疾、目赤肿瘤等症。秦皮中含有多种内酯类成分及皂苷、鞣质等，其中主要有七叶苷、七叶内酯、秦皮苷及秦皮素等。多有抗菌消炎的生理活性，七叶内酯对细菌性痢疾、急性肠炎有较好治疗效果，兼有退热作用，毒付作用小，几无苦味。适于小儿服用。1七叶苷（esculin），又叫马粟树皮苷：白色粉末状结晶，mp205206。易溶于热水（1：15），可溶于乙醇（1：24），微溶于冷水（1：610），难溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿。在稀酸中可水解。水溶液中有蓝色荧光。OOOHOGlu 2七叶内酯（esculetin）：黄色针状结晶，mp276。易溶于沸乙醇及氢氧化钠溶液，可溶于乙酸乙酯，稍溶于沸水，几不溶于乙醚、氯仿。OOHOHO 3秦皮苷（fraxin）：mp205。OOH3COHOOglu 4秦皮素（fraxetin）：mp227228。-17-OOH3COHOOH 一、实验原理 七叶苷、七叶内酯均能溶于沸乙醇，可用沸乙醇将二者提取出来，再利用二者在乙酸乙酯中的溶解性不同而分离之。二、实验内容（一）提取：取秦皮粗粉 150g 于圆底烧瓶中，加 400ml 乙醇回流 2 次，得乙醇提取液，减压回收溶剂至浸膏状，即得总提取物。（二）分离：在上述浸膏中加 40ml 水加热溶之。移于分液漏斗中，以等体积氯仿萃取二次，将氯仿萃取过的水层蒸去残留氯仿后加等积乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯液，以无水硫酸钠脱水，减压回收溶剂至干，残留物溶于温热甲醇中，浓缩至适量，放置析晶，即有黄色针状结晶析出。滤出结晶。甲醇、水反复重结晶，即得七叶内酯，称重_g，产率_。将乙酸乙酯萃取过的水层浓缩至适量，放置析晶，即有微黄色晶体析出。滤出结晶。以甲醇，水反复重结晶，即得七叶苷,称重_g，产率_。（三）鉴定：1化学检识：取七叶苷、七叶内酯各少许分别置试管中，加乙醇 1ml 溶解。加 1%FeCl3溶液 23滴，显暗绿色，再滴加浓氨水 3 滴，加水 6ml，日光下观察显深红色。2薄层鉴定：吸附剂：硅胶 G 样品：七叶苷、七叶内酯标准品及自制七叶苷七叶内酯的醇溶液。展开剂：甲醇甲酸乙酯甲苯（1：4：5）显色：1）UV254灯下观察，七叶苷为灰色荧光，七叶内酯为灰褐色。2）以重氮化对硝基苯胺喷雾显色，七叶苷和七叶内酯均呈玛瑙色。-18-结果：七叶苷Rf=0.04，七叶内酯Rf=0.28-19-实验四 芦丁的提取和鉴定 芦丁(Rutin)亦称芸香甙(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L。)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达12%16%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性。临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。槐花米中主要化学成分的结构及性质：1.芦丁(Rutin)淡黄色细小针状结晶，mp.174178(含三分子结晶)，188(无水物)。溶解度：水：1:100(冷)，1:200(热)甲醇：1:100(冷)，1:9(热)乙醇：1:650(冷)，1:60(热)吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热)不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。2.槲皮素(Quercetin)即芸香甙甙元，为黄色结晶，mp.313314(含2分子结晶水)，316(无水物)。溶解度：乙醇：1:290(无水乙醇)，1:23(热)-20-可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。3.皂甙 粗品为白色粉末，mp.210220(分解)。易溶于水、吡啶，能溶于200倍的甲醇中。酸水解后得白桦脂醇、槐二醇二种皂甙元及葡萄糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸内酯。OHOOHOR2OHR1R1 R2OH OOH OHH Oglurhagluglu芦丁槲皮素槐属黄酮甙OHOOHOR槐属甙槐属双甙R=OgluR=OglurhaHOHHHOHHHOHOH白桦脂醇槐二醇(1)白桦脂醇(Betulin)无色针晶，mp.251252。能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚等溶剂，难溶于石油醚及水。(2)槐二醇(Sophoradiol)-21-无色针晶，mp.219220或224。能溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇中，难溶于水。4.槐属甙(Sophoricoside)mp.298。易溶于热乙醇、热醋酸、吡啶、稀碱液；难溶于水；冷乙醇、冷醋酸；难溶于乙酸乙酯、丙酮中。5.槐属黄酮甙(Sophoraflavonoloside)mp.207208。可溶于热水及乙醇，难溶于冷水、乙酸乙酯、丙酮，不溶于乙醚等低极性有机溶剂。6.槐属双甙(Sophorabioside)针状结晶，mp.156160(含结晶水)，无水物 mp.248。易溶于吡啶，能溶于热乙醇、丙酮，稍溶于热水，不溶于弱极性有机溶剂。一、实验目的 1.了解黄酮甙的一般性质。2.掌握酸碱法提取黄酮甙的一般原理及方法。3.掌握黄酮甙（包括甙元）的鉴定方法。二、实验原理 1.芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐花米中提取芦丁。2.利用芦丁可被稀酸水解，生成甙元和糖，通过颜色反应，薄层层析，纸层析及甙元乙酰化进行检识和确认。三、实验内容（一）芦丁的提取-22-于 1000m1烧杯中加 500m1蒸馏水加热煮沸后，称取 40g槐花米粗粉，投人沸水中，直火加热煮沸 5分钟，在搅拌下小心加入石灰乳至 pH 8-8.5，加热保持微沸 20-30分钟，趁热用棉花过滤，滤渣再用调pH 8.5的石灰水 200m1煮 10分钟，趁热过滤，合并两次滤液，稍冷(60-70)用浓盐酸调至 pH4-5左右，放置过夜，即析出大量淡黄色沉淀，减压过滤，沉淀用水洗二次，然后用少量乙醇洗二次，抽干，沉淀于 60左右干燥，称重_g，即得芦丁粗品。（二）芦丁的精制 将芦丁粗品置 500ml烧杯中，加 300ml蒸馏水，再用石灰水调至 pH8，加热煮沸数分钟，使其充分溶解，趁热抽滤，滤液滴加 3mol/L盐酸至 pH4-5。放置过夜，即析出沉淀，减压过滤，用少量蒸馏水洗涤沉淀 2-3次，然后用少量乙醇洗 1次，抽干，于 70-80干燥 1小时，称重_g，即得芦丁精品，计算_，测熔点。（三）芦丁的水解甙元分离 取精制芦丁 1.5g，尽量研细，置于 500ml园底烧瓶中，加 2%硫酸 230ml，于直火加热微沸回流 2-3小时，冷却后减压过滤，所得沉淀即为槲皮素，滤液保留作糖部分的鉴定，沉淀洗后再用 95%乙醇重结晶一次，得黄色针状结晶，于 70-80下干燥，称重_g，产率_，即得精制槲皮素，测熔点。（四）糖部分的鉴定糖脎的制备 将水解母液小心地用 40%NaOH水液中和至近中性，滤除棕红色沉淀物，直火加热浓缩至约 50ml，过滤，滤液加 15g盐酸苯肼，3g 醋酸钠，于沸水浴上回流半小时，析出黄色混合糖脎，等冷却后，取出少量结晶，于显微镜下观察，鼠李糖脎为菊花形聚状针晶，葡萄糖脎为扫帚状聚针晶。滤取糖脎结晶，水洗干燥后，溶于丙酮中(约 5-7ml)，过滤，滤液加水使成 30%丙酮液，即析出葡萄糖脎，抽滤后结晶以少量丙酮重结晶一次，即得精制葡萄糖脎，测熔点(209)，滤去葡萄糖脎后的母液再加水稀释，即析出鼠李糖脎，抽滤结晶，以稀乙醇重结晶得精制鼠李糖脎，测熔点(185)。-23-（五）芦丁和槲皮素的纸层析鉴定 支持剂：新华层析滤纸，长30cm，宽酌情而定。点 样：1.自制精制芦丁乙醇液。2.芦丁标准品乙醇液。3.自制精制槲皮素乙醇液。4.槲皮素标准品乙醇液。展开剂：(1)正丁醇醋酸水(4:1:5)(上层)上行展开。(2)15%醋酸水溶液上行展开。显 色：(1)可见光下显黄色斑点，紫外光下观察荧光斑点。(2)用氨熏后再观察。(3)喷1%三氯化铝试液后再观察。（六）芦丁和槲皮素的薄层层析鉴定 吸附剂：聚酰胺板。点 样：同纸层析。展开剂：(1)乙醇水(3:2)。(2)80%乙醇。显色剂：(1)同纸层析。(2)喷2%二氯氧化锆溶液后观察。画出图谱，计算Rf值。（七）槲皮素五乙酰化物的制备 取槲皮素 0.5g，溶于 100ml无水吡啶中，于水浴上加温振摇，使其完全溶解，加入 10ml醋酐，摇匀，于水浴上回流加热半小时，放冷。将反应液在搅拌下倒入冰水中，一直搅拌到油滴消失，白色-24-固体沉淀析出为止，减压过滤，沉旋用蒸馏水洗至中性，于 100干燥，再用乙醇重结晶，得五乙酰基槲皮素无色针晶，测熔点(193-195)。（八）芦丁及其甙元的性质试验 1.对不同强度碱液的溶解试验 取四支小试管，每管中加人芦丁数毫克，分别加入稀氨水，5%碳酸氢钠，5%碳酸钠和 1%氢氧化钠水液各 1毫升，振摇后观察其溶解情况，溶解的溶液应呈黄色，再加数滴盐酸酸化，黄色褪去或变浅，并有沉淀析出或变混浊。2.莫氏(Molish)反应 取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加 0.5毫升乙醇溶解，再加-萘酚数毫克，振摇使之溶解，然后沿试管壁加浓硫酸约 0.5毫升，静置，观察，两液层界面变化，呈紫红色环者示分子中含糖结构。3.斐林(Fehling)反应 取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加 0.5毫升水加热使之溶解，加浓盐酸 5滴加热 5分钟，再加 5%NaOH调至 pH8。然后加斐林试剂 2毫升，于水浴上加热，如产生砖红色或黄色沉淀者示有还原糖或其它还原物质。4.盐酸-镁粉反应 取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加 0.5毫升稀醇热溶，加镁粉少许，滴加浓盐酸，溶液由黄色逐渐变红者示有黄酮类化合物存在。5.三氯化铁反应 取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加 0.5毫升水或乙醇使之溶解，然后滴加 1%三氯化铁乙醇液，观察颜色变化（比较芦丁和槲皮素的呈色反应）。6.三氯化铝反应-25-取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加甲醇 0.5毫升使之溶解，然后加 1%三氯化铝甲醇溶液数滴，黄酮类化合物应呈鲜黄色。7.醋酸铅沉淀试验 取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加 0.5毫升水或稀甲醇使之溶解，加5%中性醋酸铅溶液数滴，观察有无沉淀产生，再加碱式醋酸铅饱和溶液数滴，观察有无沉淀产生。8.醋酸镁反应 取芦丁和槲皮素各数毫克，分别置于两支小试管中，加 0.5毫升甲醇使之溶解，加入 1%醋酸镁甲醇溶液数滴，黄酮类应呈黄色荧光。-26-实验五 葛根中黄酮类化合物的提取、分离及鉴定 葛根为豆科植物葛(Puerari lobata(Willd)Obwi)的块根。葛根味甘辛，性平，能解肌退热，生津止渴，发表透疹，止痢等。主治温病发热，头痛项强，口渴泻痢，麻疹起等症。葛根中主要含有黄酮类化合物：葛根素、葛根甙、大豆黄酮、大豆黄酮甙等。葛根的煎剂、醇提物、总黄酮等都具有扩张冠状动脉血管和脑血管的作用，同时也有降低血压作用。常用于治疗冠心病心绞痛（葛根片）及高血压项背强痛以及突发性耳聋等。葛根中主要成分的结构与性质：1.葛根素(Puerarin)（葛根黄素）：梭晶，mp.187(d)。易溶于乙醇，不与中性醋酸铅反应生成沉淀。2.葛根甙(Xylopuerarin)（葛根素木糖甙）：木糖位置未定。棱晶，易溶于乙醇，不与中性醋酸铅反应生成沉淀。3.大豆黄酮(Daidzein)：棱晶，mp.320(d)，易溶于乙醇，不与中性醋酸铅反应生成沉淀。4.大豆黄酮甙(Daidzin)：针晶，mp.236237(d)，无荧光，易溶于乙醇，不与中性醋酸铅反应生成沉淀。OR1R2OOHRR1 R2 R3glu OH glu H xyl H OH H Oglu葛根素葛根甙大豆黄酮大豆黄酮甙 一、实验目的 1.学习葛根中黄酮类化合物的提取分离方法。-27-2.熟悉铅盐沉淀法除去杂质或沉淀有效成分的一般原理及方法。3.熟悉柱层析法在