油浸镜的使用和细菌形态结构的观察.doc.pdf

实验一油浸镜的使用和细菌形态结构的观察Use of oil immersion objective and observation of morphoiogy structures lf bacteria一、油浸镜的使用方法观察细菌时，须用放大倍数最大的物镜，即油浸镜（Oil immersion objective，简称油镜）。其原理如图一所示，当光线从标本经过空气进入镜头时，由于介质密度不同而发生光的折射（散光现象），光线不能完全进入物镜中，致使物象显现不清。若在油镜与载物玻片中间加入和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则不使通过的光线有所损失，视野亮度增强，获得清晰物象。(一)油浸镜的使用方法1、双手托显微镜，轻拿轻放。2、放好后，用绸布擦试显微镜，同时检查显微镜有无问题，有问题立即向老师报告。3、用低倍镜调整光线，看染色标本时，要求视野达到最亮的程度。将集光器升到最高位置，与载物台相平。将虹彩完全开放。天然光线用平面反射镜，人工光源用凹反射镜。使视野达到最亮的程度。4、在标本上滴一滴香柏油，不要多加。用眼睛从侧面观察，小心转动粗调节器，使油浸镜头缓慢下降，浸入油中，到几乎或轻轻与玻片接触为止。不能过急过重，以免碰坏镜片。5、一面从目镜观察，一面用粗调节器慢慢上升油浸镜头，当见到模糊的物象时，立即停止。再用细调节器调到物像清晰为止。然后，一边移动片子，一边观察，寻找理想的视野，仔细观察。6、看完后，先将油浸镜头上提，然后取下标本片，再用擦镜纸拭去镜头上的香柏油。必要时，用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，然后再用另一小块擦镜纸拭去二甲苯。7、最后，降下集光器，竖起反射镜，下降镜筒使物镜成八字形抵于载物台绸布上，双手托持显微镜，放入显微镜箱中。(二)注意事项1、不得在直射阳光下操作显微镜，以免强光损坏镜片。2、显微镜的细调节器是精密而脆弱的机件，只能做有限的旋转，因此，不得向一个方向连续旋转数周。当旋转时感到有阻力，则表明已达极限，不能再继续向上方旋转，必须立即退回，轻拿轻放，防止细调节器因震动而损坏。3、显微镜必须保存于干燥、无尘的方，以防镜片发霉损坏。二、细菌的基本形态、特殊构造的观察细菌的基本形态（球菌、杆菌、螺形菌）和细菌的特殊构造（荚膜、鞭毛与芽胞等）都图 1油浸镜原理示意图-35-可以在染色之后，用油浸镜观察(一)细菌的基本形态观察注意观察细菌的形态、大小、排列和染色性。1、球菌和杆菌（葡萄球菌和大肠杆菌）革兰氏染色标本，葡萄球菌染成紫色，大肠杆菌染成红色。2、弧菌（霍乱弧菌）革兰氏染色标本，霍乱弧菌染成红色。(二)细菌的特殊构造观察1、荚膜（肺炎球菌）Hiss 氏荚膜染色法，菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色。2、鞭毛（变形杆菌）户田氏鞭毛染色法，菌体和鞭毛均染成红色。3、芽胞（破伤风杆菌）Moeller 氏芽胞染色法，菌体染成兰色，芽胞染成红色。三、细菌大小的测定细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计二种，接目镜刻度是相对的，在同一接目镜下，它是随着不同放大率的接物镜而改变相对比例，而镜台测微计上所刻的长度是绝对的用来校正接目测微计每格所代表的大小。材料：光学显微镜、接目测微计、镜台测微计。方法：1、将接目测微计装入接目镜内的横隔上，刻度向下，置镜台测微计于镜台上。2、在接目镜下寻镜台测微计的刻度（这时光圈宜小，因光线暗才能使刻度更为清楚。需要用那一放大率的接物镜观察标本，则在校正接目测微计时就用那一个接物镜头。3、移动镜台测微计和转动接目测微计使二者刻度平行，并使二者的起始线相重迭，数出二条重迭线之间在两个测微计上的格数即可求出接目测微计每格的长度。接目测微计与镜台测微计二个重迭点间的距离越长，则所得的数字越精确。4、接目测微计每格长度的计算：镜台测微度总长度为 1 毫米，其上刻有 10 大格，每格划有 10 小格，所以每小格=1/100=10m（因为 1mm=1000m）。例：今测得高倍显微镜（油镜）的接目测微计 50 格相当于镜台测微计 7 格，则接目测微计每格长度为：710m1.4m/格505、校正后移去镜台测微计，将细菌玻片标本置于镜台上，找到目的物后，移动接目测微计（或移动标本），测定细菌长与宽各占儿格，求得其大小。细菌的大小=测得之格数接目测微计每格长度。6、实验完毕后，取出接目测微计，其中如有油腻或手印，则用擦镜纸拭净。-36-实验二常用培养基的制备和常用热力灭菌器及使用方法Preparation of common culture medium and sterization methods by heat一、常用培养基的制备培养基是用人方法将多种营养物质按微生物生长需要配成的一种营养基质。常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。其制备步骤大致是：按一定配方称取各种物质、溶解、修正pH，分装在一定的容器内，灭菌。使用前保证无菌状态。常用的培养基有下列几种，简介其制备方法和用途。(一)肉汤培养基材料：肉膏 0.5g蛋白胨 1.0gNacl 0.5g蒸馏水 100ml方法：1、将上述材料混合，加热溶解，放凉。2、用精密 pH 试纸试酸碱度，用 10碳酸钠（Na2CO3）或 1N 氢氧化钠（NaOH）矫正 pH为 7.2 左右。过碱时可用 10醋酸或 1N 盐酸矫正。必要时可用比色箱或酸度计更准确地测定酸碱度。3、分装于试管中或放三角烧瓶中，用15 磅高压蒸气灭菌 20-30 分钟。待用。用途：主要用于增菌和观察细菌在液体培养基中的生长状态（沉淀生长、混浊生长和表面生长）。(二)营养琼脂培养基材料：合成营养琼脂 4.8g（视制剂说明）蒸馏水 100ml方法：混合，加热溶解，勿需调 pH。分装于试管和三角烧瓶中，一并高压灭菌。灭菌后，将试管倾斜放置，冷却后则成斜面培养基；三角烧瓶中的培养基趁热倒入灭菌平皿中，冷却后即成琼脂平板。用途：琼脂平板用于分离细菌等；琼脂斜面用于细菌纯培养和菌种保存等。(三)血液琼脂培养基材料：营养琼脂培养基 100ml脱纤维的新鲜羊血或兔血 5-10ml方法：将营养琼脂加热溶化（或高压灭菌后），待冷即到 50左右时，无菌操作将羊血或兔血加入后混匀，分别注于无菌平皿或试管中，制成血平板或血斜面。用途：供培养要求较高的细菌。-37-(四)半固体培养基材料：合成半固体培养基 1.0g（视说明）蒸馏水 100ml方法：混合，加热煮沸溶解，分装于小试管中，高压灭菌后，直立，使之凝固成高层。用途：供测定细菌的动力和保存菌种。(五)蛋白胨水培养基材料：蛋白胨 1.0g Nacl 0.5g蒸馏水 100ml方法：1、按量称取后混合加热溶解。2、矫正 pH 为 7.2-7.6。3、分装后高压灭菌。用途：蛋白胨水中不含糖类，常用于制备糖发酵培养或用检查细菌的靛基质反应等。二、常用热力灭菌器及其使用方法（示教）高温能使微生物蛋白质凝固变性，故高温能杀灭所有的病原微生物。在医学实践中常用下述热力灭菌。(一)干烤箱（干热灭菌器）干烤箱是用两层金属板制成的箱子，中间充以石绵，箱底有热源（电炉），并附有温度计和自动调节器。灭菌时，打开通气口，加热到80时，关闭通气口，加热到160-170时，保持两小时，即可灭菌。最高温度不得超过 180，超过 180则棉塞和包装纸会被烤焦。灭菌后，待温度下降到 40以下，再开箱取物，防止玻璃器材因骤冷而破裂。耐高热和干烤的玻璃器材、磁器等常用此法灭菌。如培养细菌用的试管平皿、吸管等，经清洗和晾干之后，进行干热灭菌。为了使灭菌后的器材保持无菌状态，烧瓶和试管要塞上棉塞，平皿和吸管要放入特制的筒内或用纸包好再行灭菌。(二)流通蒸汽消毒器实验室常用的流通蒸汽消毒器，其原理和一般的蒸锅相同。消毒时，用流通蒸汽（100）蒸 30 分钟，可消毒用过的细菌培养物和病人的衣物等。10030 分钟，不能灭尽芽胞，达不到灭菌的要求。一些不耐高热的含糖或牛奶培养基，可用流通蒸汽消毒器进行间歇灭菌，即每天 10030 分钟，连续进行三天；不加热时，把培养基放在室温中，使其中的芽胞发育成繁殖体，于次日加热时将其杀死。(三)高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器是一个能密闭的耐高压的金属圆简，附有加水、贮水、排水、加热、排汽活门、安全活门和压力计等装置。小型的手提式高压蒸汽灭菌器，结构简单，使用方便。高压蒸汽灭菌器的使用方法如下：1、先向筒内注水，然后把要灭菌的物品装入内筒，再把盖拧紧，打开排气活门，开始加热。-38-2、水沸腾后，排气活门开始排出气体，待筒内冷空气全部排出后，关闭排气活门。此时筒内压力逐渐上升。3、待筒内压力达到所需磅或公斤数时，调节热源，维持一定时间，一般是15 磅（温度为 121.3）20-30 分钟，即可达到灭菌的目的。4、达到灭菌所需时间后，关闭热源，自然放凉，待压力表指针下降到“0”时，方可开盖取物。使用高压灭火器灭菌，是最有效而又迅速的方法。凡不怕高热的普通培养基、药品、手术器械、外科敷料等，均可用此法灭菌。为保证灭菌效果和安全。器内要加入足量的水，装入的物品不要过挤，冷空气必须排尽，注意压力表的工作情况，防止因压力表失灵而造成事故。-39-实验三细菌的培养法和细菌的分布Bacterial culture and Bacterial distribution一、细菌的培养法根据培养基的物理性状（液体、固体、半固体）的不同，培养方法也不同。常用的培养方法有：平板培养法、斜面培养法、高层培养法和液体培养法。材料：琼脂平板、琼脂斜面、半固体高层和肉汤培养基，大肠杆菌、枯草杆菌的培养物等。方法：1、平板培养法（分离培养法）：临床上常用的检验标本，如粪、痰、脓汁等中常混有多种菌。欲从病人标本中检出某种病原菌时，必须先将各种菌分开，获得纯菌，然后再做进一步鉴定，这样才达到目的。琼脂平板面积大，通过一定的方法进行培养，则可达到分离各种细菌目的。平板培养法种类很多，现将三段划线法介绍如下：将接种环火焰灭菌后，取检查材料，反复涂于平板上端。将接种环火焰灭菌后，把涂于平板上端的材料，划线于“1”区。将接种环火焰灭菌后，把“1”区部分材料划线于“2”区。将接种环火焰灭菌后，把“2”区部分材料划线于“3”区。划线完了后，盖好平板，灭菌接种环。于盛琼脂的底面玻璃上注明日期和姓名，放37培养 18-24 小时。2、斜面培养法：斜面培养基不易污染，常用于培养纯种细菌（纯培养）。先将接种环灭菌，然后挑取平板上弧立菌落上的细菌。拔去斜面培养基的棉塞，试管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上划一直线，然后将接种环再自下而上，连续平行划线。接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞。灭菌接种。在试管上写好菌名，日期。37培养 18-24 小时。3、液体培养法：用于增菌，并可观察细菌的生长状态和检查生化反应。用灭菌接种环取少许纯菌。按无菌操作要求，将沾有细菌的接种环伸入液体培养管中，在稍高于液面的管壁上，轻轻研磨，使细菌落入液体培养基中。接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞。灭菌接种环，在试管上做好标记。37培养 18-24 小时。4、半固体培养法（穿刺培养法）：常用以检查细菌运动或检查细菌发酵能力。用灭菌接种环（白金针）取少许纯菌。按无菌操作要求，将沾有细菌的接种针，从半固体培养基的正中刺向管底，但不到底，-40-留有 0.5 厘米左右。然后，按原线抽出。同上。二、细菌的分布细菌种类繁多，繁殖迅速，分布广泛。不论空气、土壤、水、食物、各种物体和器械的表面，以及动物和人体与外界相通的腔道中都有细菌存在。因此，了解细菌在自然界及正常人体中的分布，对于在医疗实践与某些科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。(一)空气细菌的检查材料：普通琼脂平板。方法：将普通琼脂平板置于室内不同地方，打开盖子，暴露于空气中5-10 分钟，盖好，放 37温箱，培养 24 小时。结果：观察平板上菌落的数目。(二)土壤中细菌的检查材料：地表土壤，肉汤培养基。方法：取少量土壤放入肉汤培养基内，37培养 24 小时。结果：观察细菌生长状况。(三)手指等的细菌检查材料：普通琼脂平板。方法：将手指、钱币、衣物等直接涂于琼脂平板上，注意勿将琼脂表面弄破，37培养24 小时。结果：观察平板上细菌生长的情况。(四)口腔中细菌的检查材料：血液琼脂平板。方法：将平皿盖打开，向血液琼脂表面连续咳嗽二、三次，盖好后，37培养 24 小时。结果：观察平板上细菌生长的情况。-41-实验四细菌生长状态及运动观察Observation of bacterial growing state and motility一、细菌生长状态观察细菌不同，在培养基上的生长状态也不相同。通过观察细菌生长状态，有助于鉴定细菌。(一)琼脂平板上菌落观察一个细菌在固体培养基上，经过一定时间的生长繁殖之后，所形成的肉眼可见的细菌集团，称为菌落。很多菌落连在一起，融成一片，称为菌苔。由于细菌种类不同，以及培养基的成分不同，形成的菌落特点也不同，可呈现一定的形态、色泽等，有助于鉴别细菌。因此，应当对菌落进行认真观察。其观察要点如下：1、大小：以直径（毫米）表示之，1 毫米左右为小菌落，2-3 毫米为中等大落，3 毫米以上为大菌落。2、形状：圆形、卵园形及不规则形。3、边缘：整齐或不整齐、锯齿状、毛发状等。4、表面：光滑、湿润皱纹、干燥等。5、隆起度：扁平、凸起、中心凹陷等。6、透明度：透明、半透明、不透明。7、颜色：无色、白色、黄色等。8、溶血性：在血平板上产生溶血毒素的细菌，可以使培养基中的红细胞破坏溶解。可分为完全溶血，草绿色溶血及不溶血。根据菌落的特点，可分为光滑型（S 型）菌落和粗糙型（R 型）菌落。S 型菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润。R 型菌落与之相反。(二)斜面上生长状态观察：可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，则表明污染了杂菌。(三)液体培养基中生长状态观察：未培养前的液体培养基多为清澈透明的。接种细菌培养后，由于细菌种类不同，可有以下三种生长形式：1、混浊：液体变为混浊。2、菌膜：液体澄清，表面有一薄膜。3、沉淀：管底有沉淀物。(四)半固体中生长状态观察：无鞭毛（无运动）的细菌，以培养后仅沿穿刺线生长，培养基清亮。有运动的细菌，沿穿刺线向外扩散，穿刺线模糊不清，培养基混浊。二、细菌运动观察应用不染色标本可观察活细菌的运动和状态，且能避免由于某些染色操作而引起的细菌变形。常用的不染色标本的制备方法有悬滴法、压滴法及暗视野显微镜检查法等。材料：枯草杆菌和葡萄球菌混合菌液、盖玻片、凹玻片、凡士林油及暗视野显微镜。方法：-42-取清洁的凹玻片和盖玻片各一张。涂少许凡士林于凹玻片窝的周围；取一接种环菌液滴于盖玻片之中央；将盖玻片迅速翻转，盖于凹窝上。轻压盖片，使其固定并密封，防止菌液变干，便于长时间观察。镜检方法：将集光器稍降下，使视野内光线变暗。用低倍镜检出悬滴边缘，然后换高倍镜或油镜观察细菌的形态和运动。枯草杆菌有鞭毛能运动，它们在运动时各向不同方向进行，速度较快，相互间的位移很大，称之为真性运动或固定运动。葡萄球菌没有鞭毛不能运动，但由于受水分子的撞击而呈分子运动（布朗氏运动），只在原地颤动，位移不大。(二)压滴法取混合菌液 1-2 滴，放于载物玻片中央，小心地把盖玻片放入液滴之上。镜检方法与悬滴方法相同。压滴法比悬滴简单，但标本容易干涸，不能作长时间观察。(三)暗视野显微镜检查法镜检方法将混合菌液直接滴于载物玻片上，加盖玻片，做成压滴标本。在标本未放载物台上之前，调节光源光镜，此时在暗视野集光器的面上可以看到一个光圈，用低倍接物镜来观察光圈并转动集光器上的螺旋，使光圈位于视野正中，在集光器上加镜油一滴。降低集光器，放标本于载物台上，徐徐升高集光器，使油滴与玻片接触，但避免油滴中有气泡产生。用低倍接物镜观察标本。这时可以看到一个光点，升降集光器使光点集中而且光度强烈，并使光点位于视野正中。在标本的盖玻片上加镜油，改用油浸镜观察。此时应放开接物镜上的虹彩，转动镜筒的调节螺旋，待初步看到物像的轮廓以后，再慢慢缩小接物镜上的虹彩，直至视野完全无光，而被检微生物清晰可见。注检查牙垢时可先在载物玻片上置生理盐水一滴，加入牙垢少许，盖盖玻片，做成压滴标本进行暗视野检查。【原理】由于活的细菌、螺旋体等体积微小而且半透明，在普通显微镜下不易看清楚，如果用暗视野显微镜，即在普通光学显微镜上安装一个特制的集光器一暗视野集光器（图 2），其中央为不透明的黑板所遮，光线不能直接通向镜筒，仅可从其四周边缘斜射到载玻片标本上。因光线不直接上升，所以视野背景是暗的。从集光器斜射到细菌等微粒上的光线，由于散射作用而发出亮光，反图 2抛物面型暗视野集光器射到接物镜内。故在强光照射下，可以在黑色的1、光束 2、遮光板视野中看到发亮的菌体。犹如黑夜的天空，闪烁 3、标本 4、射入镜筒光线着点点星光；也正象我们在暗室内，能看见从隙缝漏入的阳光内，有千万颗尘埃微粒跳跃飞舞其中一样。-43-实验五革兰氏染色法Grams stain一、革兰氏染色法革兰氏染色法是最常用的细菌鉴别染色法。要求同学必须掌握此项基本技术操作，并理解革兰氏染色法在鉴别细菌上的重要意义。1884 年由 Gram 氏建立，因之得名。关于其原理还不完全清楚，曾有几种不同的解释：1、革兰氏阳性菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层很厚，脂类含量低，酒精不易透入。阴性菌的细胞壁较为疏松，肽聚糖很薄、外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫一碘复合物被酒精溶解提出而致脱色。2、革兰氏阳性菌含有多量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘结合成大分子复合物，不易脱出。而阴性菌中此物质含量甚少，故易于脱色。3、革兰氏阳性菌等电点（pH2-3）比革兰氏阴性菌（pH4-5）为低，在同样 pH 的染色环境中，阳性菌所带的阴电荷比阴性菌多，故与带阳电荷的结晶紫染料结合较为牢固，不易脱色。目前认为，在以上各因素中，细胞壁结构上的差异是最重要的因素。材料：葡萄球菌与大肠杆菌的混合菌液。革兰氏染色液，载物玻片等。方法：1、涂片：先将接种环（白金耳）用火焰灭菌，用灭菌的接种环取菌液一滴，在载物玻片上涂一个薄而均匀的涂膜，直径约为1 厘米。如用纯培养菌做涂片时，应先取一滴生理盐水放于载物玻片上，再取少量纯菌，混于盐水中，然后再涂片。2、干燥：放空气中自然干燥，或于火焰上部略加烘烤，使液体干燥。3、固定：将玻片从火焰中央部，反复通过三次。使涂片中细菌，固着于载物玻片上，并杀死大部分细菌。4、取结晶紫液滴于涂膜上，染1 分钟，水洗。5、用芦戈碘媒染 1 分钟，水洗。6、用 0.4石碳酸复红液脱色复染半分钟，水洗。7、印干后，用油镜观察。结果：经革兰氏染色后，凡染成紫色的的细菌称之为革兰氏阳性菌；凡染成红色的细菌称之为革兰氏阴性菌。表 1常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌染色性微生物球菌杆菌其它微生物-44-革兰氏阳性菌（G）葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等。能形成芽胞的杆菌（炭疽杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、气性坏疽病原菌等）、白喉杆菌、抗酸性菌（结核杆菌）。真菌+革兰氏阴性菌（G）奈瑟氏菌属（脑膜炎球菌、淋球菌等）。绝大多数杆菌（肠道杆菌、布氏杆菌、鼠疫杆菌、百日咳杆菌等）、弧菌。螺旋体、立克次氏体、支原体。-附：常用细菌染色液的配制(一)染料酒精饱和液（原液）的制备：由于染料的纯度不同，用量可有不同。1、美兰酒精饱和液：美兰 5-7 克+95酒精 100 毫升2、碱性复红酒精饱和液：碱性复红 10 克+95酒精 100 毫升3、结晶紫酒精饱和液结晶紫 5 克+95酒精 100 毫升(二)碱性美兰液：单染色和抗酸染色等用。美兰原液 30 毫升0.01KOH 100 毫升(三)结晶紫液：革兰氏染色用。亦可用龙胆紫液代替，配法相同。结晶紫原液 20 毫升1草酸铵水溶液 80 毫升(四)芦戈氏碘液：革兰氏染色用。先用几毫升蒸馏水将 2 克碘化钾溶解，再加 1 克碘，在碘溶解之后，再加蒸馏水，最后总量为 300 毫升。(五)石炭酸复红液，用于抗染色法和芽胞染色法。碱性复红原液 10 毫升5石炭酸水溶液 100 毫升(六)稀释石炭酸复红液：革兰氏染色法及单染色用。将石炭酸复红液用蒸馏水稀释10 倍即可。二、特殊构造染色法细菌的特殊构造有荚膜（Capsule）芽胞（Spore）、鞭毛（Flagellum），特殊构造用一般染色法不易着色，必须用特殊的染色法才能着色。某些细菌的特殊构造的检查，有助于细菌的鉴别。(一)Hisscapsule stain1、涂片、干燥、固定。2、结晶紫液加温染色 1 分钟，弃去染色液。3、用 20硫酸铜水溶液冲洗。4、印干、镜检。(二)Flagellum stain（户田法）1、将具有鞭毛的细菌轻轻涂于完全无脂的玻片上，自然干燥。2、用户田氏染色液染色0.5-5 分钟，水洗。3、印干、镜检。菌体和鞭毛均染成红色。户田氏染色液的配制：混合，滤过。混合，滤过。混合，滤过。-45-甲液：明矾饱和水溶液 2份5石炭酸水溶液 5 份20鞣酸水溶液 2 份乙液：复红原液 1份甲液、乙液用前混合，过滤(三)Spore stain1、涂片、干燥、固定。2、用 5碳酸复红液加温染色5 分钟，水洗。3、用 95%酒精脱色 20 秒，立即水洗。4、用碱性美兰（吕氏美兰）溶液复染1 分钟，水洗。5、印干、镜检菌体染成蓝色，芽胞染成红色。混合-46-实验六细菌对药物的敏感性与耐药性试验Sensitivity and resistance test of bacteria on medicine一、细菌的药物敏感性试验（简称药敏试验）细菌因其种或株的不同，对药物的敏感性也不同。有的在与药物相互作用中还会改变敏感性。因此，临床上测定病原菌对药物的敏感性，对选用抗菌素、磺胺和中草药治疗细菌引起的疾病、发现耐药菌和及时控制感染都有重要的意义。药敏试验有稀释法与扩散法。最常用的有试管稀释法和纸片扩散法。(一)试管稀释法材料：青霉素：用无菌蒸馏水配制成50 单位/毫升。菌液：金黄色葡萄球菌 6 小时肉汤培养物，用肉汤稀释十倍使其浓度约为3 亿菌体/毫升。肉汤培养基。无菌小试管，无菌 1 毫升吸管。方法：1、取无菌小试管 15 支排列于试管架上，第 1 管内加入肉汤 1.8 毫升，第 2-15 管内各加入肉汤 1 毫升。2、第1 管内加入抗菌素（青霉素）0.2 毫升，混匀后吸出1 毫升加到第 2 管中。按此法依次作倍量稀释直至第 14 管，吸出 1 毫升弃去；第 15 管不加抗菌素作为对照。3、在上述各试管中，用无菌吸管加入葡萄球菌稀释液0.1 毫升。混匀后置37温箱内，培养 18-24 小时观察结果。结果：试管中肉汤呈均匀混浊，表明有菌生长（即与对照管相同）。如肉汤澄清，则细菌受抑制，抑菌生长之最低抗菌素浓度，即细菌对该抗菌素的敏感度，用单位或微克/毫升表示之。(二)纸片法材料：从病人脓汁中分离出并鉴定为金黄色葡萄球菌。各种抗菌素滤纸片：市售的抗菌素滤纸片（上海第六人民医院检验组制），每枚滤纸片的含药量为：青霉素为 1 单位，其它抗菌素为 10 微克（g）磺胺为 100 微克（g）,痢特灵为 5 微克（g）。普通琼脂平板，无菌镊子及接种环等。方法:1、用灭菌的接种环取纯培养的葡萄球菌少许，经反复划线使之均匀地分布在琼脂表面。2、用灭菌的小镊子，将含药滤纸片于平板的表面，并轻轻地压紧。每个平板可贴4-5种滤纸片，其间距为 2-3 厘米。3、置 37温箱内培养 18-24 小时，观察结果。-47-结果：细菌如对抗菌素敏感，则在滤纸片的周围出现抑菌环。测定抑菌环直径的大小（毫米）即可知其敏感性。本试验敏感度参照下述标准判定：抑菌环直径在 15 毫米以上为高度（或极度）敏感；10-14毫米为中度敏感；10 毫米以下为低度敏感；无抑菌环为不敏感（耐药）。二、细菌 R 质粒接合转移试验在细菌的变异中，以药物从敏感变成耐药也是经常发生的一种生物学现象。细菌的耐药基因位于染色体上或 R 质粒。有些耐药的细菌，特别是肠道杆菌，带有可传递的耐药性质粒（resistance plastid,R 质粒），这种耐药性质粒 DNA 可经细菌接合，由供体菌转移给受体菌，使受体菌也获得相应的耐药性。材料：1、供体菌为多重耐药的痢疾杆菌D15株，Sm、Cm、Tc（耐链霉素、氯霉素、四环素）。2、受体菌为大肠杆菌 K12W1465株，Rif（耐利福平）。3、肉汤培养基、伊红美兰平板（或中国兰平板）、含Cm20g/ml，Rif100g/ml 的伊红美兰平板（或中国兰平板）。方法：1、细菌活化(1)将供、受体菌分别接种于伊红美兰平板上，37过夜。(2)分别将两种菌转种于1ml 肉汤中，37培养 5-6 小时。2、接合(1)吸取供、受体菌液各 0.02ml 于 0.5ml 肉汤中混匀，37水浴中接合 2 小时。(2)在含 Cm+Rif 的伊红美兰平板上按图 3 涂布接合菌、受体菌和供体菌各0.05ml，置 37培养过夜。结果：在 Cm+Rif 伊红美兰（或中国兰）平板上，供、受体菌均不生长，只有接合菌长出较大、不透明的黑紫色（或兰色）菌落。附：噬菌体的特异性溶菌试验噬菌体（bacteriophage）是细菌的病毒，它可以使相应的细菌溶解，这种溶解作用具有高度特异性，故可用于细菌的鉴定和细菌分型。此外，由于噬菌体可作为一种DNA 片断的载体，把某些基因带到宿主细胞中去与DNA 整合，引起后者发生变异，目前噬菌体已成为研究分子生物学的一种重要工具。材料：痢疾杆菌培养物与相应的噬菌体，伤寒杆菌的噬菌体，营养琼脂平板培养基。方法：1、取一接种环痢疾杆菌致密划线于营养琼脂平板上。-48-rrrr图 3 Cm+Rif 伊红美兰平板接种菌示意图2、用吸管滴加痢疾杆菌的噬菌体一滴，滴于平板的一端，倾斜平板，使噬菌体液沿与划线垂直方向流下。3、用吸管滴加伤寒杆菌的噬菌体液一滴于平板另一端，倾斜平板，使噬菌体液沿与划线垂直方向流下。4、37培养 18-24 小时后观察结果。结果：有痢疾杆菌噬菌体处细菌被溶解，无细菌生长；而有伤寒杆菌噬菌体处，细菌不被溶解，细菌仍生长良好。-49-实验七脓汁中化脓性球菌的分离与鉴定(综合性实验)(Isolation and identification of phylogenic coccus in pus)在脓汁中常可检出金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型链球菌与肺炎球菌等化脓性球菌，此外也可检出杆菌如大肠菌，变形杆菌、结核杆菌，枯草杆菌等。本实验是用脓汁材料检查金黄色葡萄球菌。材料：1、标本：脓汁2、培养基：血平板、甘露醇发酵管。3、家兔血浆、生理盐水、玻片、革兰氏染色液一套。方法：(一)化脓性球菌的检查程序。直接涂片革 兰 氏 染镜检甘露醇发酵+致病性鉴定G 葡萄串状排列纯培养血浆凝固酶透明溶血环乙链标本G+链状排列无溶血环丙链（脓汁）草绿色溶血环甲链胆汁溶菌试验菊糖发酵试验奥普托欣试验+G 矛头状成双排列草绿色溶血环分离培养小鼠毒力试验菌落观察生化反应-G 染色G 肾形成双排列纯培养鉴别生长血清学凝集试验(二)致病性葡萄球菌分离与鉴定1、直接涂片：G 染色观察形态、排列及染色性，初报结果。2、分离培养：脓汁经三区划线接种于血平板上，置 37温箱培养 18-24 小时，取可疑菌落接种于斜面培养基进行纯培养。3、致病性鉴定：甘露醇发酵试验：取纯培养物接种于甘露管中，37孵育 18-24 小时后观察结果。血浆凝固酶试验：采用玻片法。在玻片两端各滴一滴生理盐水，取少许纯培养物与之混匀成菌液。在一端加入兔血浆一滴混匀，另端不加兔血浆作对照。立即观察结果，出现颗粒凝集者为阳性，无凝集者为阴性。结果判定：根据上述分离与鉴定结果综合判定。-50-实验八抗链球菌溶血素“O”试验(Anti-streptolysin“O”test)乙型溶血性链球菌能产生溶解人或家兔红细胞的溶血毒素“O”，此毒素具有很强的抗原性，人受溶血性链球菌感染后，经2-3 周即可产生抗溶血毒素“O”的抗体。此抗体可以中和溶血毒素“O”，此抗体常在病愈后数月至年余才消失。因此凡检出病人血清中抗溶血毒至少“O”抗体效价显著增高时，可以认为病人最近受过溶血性链球菌感染或反复受过溶血性链球菌的侵害，如风湿热及急性肾小球肾炎等。本试验简称为抗“O”试验。有间接凝集法和中和法两种方法。一、抗“O”试验-间接凝集法材料：1、待检血清、阳性与阴性控制血清2、溶血毒素“O”溶液3、ASO 胶乳试剂4、反应板、试管、吸管或加样器方法：1、将待检血清用生理盐水稀释成1：50，经 5630 分灭活后待用。2、在反应板上分别滴加 1：50 待检血清、阳性及阴性控制血清各一滴，再各滴加一滴溶血毒素“O”溶液。轻轻摇 2 分，充分混匀。3、各滴加一滴 ASO 胶乳试剂，20室温下轻摇 8 分钟。有清晰凝集者为阳性，反之为阴性。4、阳性者，再将血清稀释成1：80，重复操作，有清晰凝集者为强阳性。结果判定：1、强阳性者 ASO833 单位；2、阳性者 ASO500 单位；3、阴性者 ASO250 单位。该试验阳性，可作为风湿热、急性肾小球肾炎等链球菌感染有关疾病的辅助诊断。二、抗“O”试验_中和法材料:1、待检血清，1红血球悬液。2、溶血素“O”和还原剂（亚硫酸钠）。3、生理盐水、0.4枸橼酸钠盐水。4、采血针、小试管、吸管等。方法：-51-1、待检者耳垂消毒后针刺取血0.1 毫升，放入0.9 毫升 0.4枸橼酸钠盐水中。室温静置或离心使血细胞下沉，上清液即为待检血清（按 1：20 计算）。管底的血细胞再混悬于 5毫升生理盐水，即成为 1红细胞悬液。2、取溶血素“O”及还原剂各一片，置于小试管内，加生理盐水1 毫升，用玻璃棒搅碎后，在室温放置 15 分钟，使溶血素“O”恢复活力。即致活溶血毒素“O”。最后补加盐水 9毫升即可。3、按下表将患者血清倍量稀释，并添加致活的溶血素“O”，进行实验。试剂 1 2 3生理盐水 0.9 0.5 0.5弃去患者血清（1：20）（ml）0.1 0.5 0.50.5血清稀释倍数 1：200 1：400 1：800致活溶血素“O”（ml）0.25 0.25 0.25置 37水浴 15 分钟1细胞结果：溶血者液体呈鲜红色，液体澄清，不溶血者液体浑浊。完全不溶血的血清最大稀释度即为该血清的抗“O”效价。例如溶血的结果为1：200（-）1：400（-），1：800（+），则效价为 1：400，亦称为 400 单位。目前临床标准是1：200 以下为阴性，1：400 以上为阳性。0.25 0.25 0.25置 37水浴 45 分钟后观察结果-52-实验九粪便标本中致病性肠道杆菌的分离鉴定（综合性实验）与肥达氏反应(Isolation and identification of pathogenic enterobacteria in stool and widal reaction)肠道杆菌是一群生物学性状相似的革兰氏阴性杆菌。一般以其生化反应和血清学反应作为鉴定依据。肠道杆菌的检查在检查水质污染，食品卫生检验及消化感染性疾病的方面均有很大意义。材料：标本：病人粪便。培养基：SS 琼脂平板及伊红美兰琼脂平板，半固体双糖铁培养基、蛋白胨水，尿素培养基。其它：吲哚试剂，沙门氏菌多价血清，痢疾杆菌多价血清、玻片、生理盐水等。方法：1、粪便的细菌分离和鉴定程序：用分区划线法将粪便接种至 SS 琼脂平板或伊红美兰琼脂平板上，置 37温箱中培养18-24 小时，取出观察菌落及供进一步试验用。2、肥达氏反应肥达氏反应系用已知沙门氏菌抗原测定病人血清未知抗体的凝集试验，临床上常用以诊断伤寒病和副伤寒病。生化反应血清学鉴定粪便标本增菌培养基SS 琼脂、伊红美兰琼脂培养基取可疑菌落革兰氏染色双糖培养基-53-材料：1、标本：病人血清（未知抗体）。2、已知抗原：伤寒“H”及“O”、副伤寒甲及乙的“H”诊断菌液。3、其他：生理盐水、大试管、小试管、无菌吸管（1 毫升及 5 毫升）、56水浴箱、试管架等。方法：1、取试管24 支。于试管架上排成四排、每排6 支，各排之第一管分别标明“TO”（伤寒杆菌菌体抗原），“TH”（伤寒杆菌鞭毛抗原）“PAH”（副伤寒杆菌甲鞭毛抗原）“PBH”（副伤寒杆菌乙鞭毛抗原）。2、取大试管一支加入生理盐水3.8 毫升及病人血清0.2 毫升混匀，使之成 1：20 稀释液。3、取上面稀释好的血清2 毫升，分别向各排的第一管各加0.5 毫升。4、于大试管中剩余的 2 毫升。稀释血清中再加入生理盐水 2 毫升，混匀后即成 1：40稀释液。5、取1：40 稀释液 2 毫升分别加入各排第二管中，每管0.5 毫升。如此类推。连续稀释血清，分别加入各排的第三管至第五管。第六管不加血清，加入生理盐水0.5 毫升作为抗原对照。血清稀释法见下表：盐水 3.8ml材料血清 0.2ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第一管1：20盐水 2 ml1血清 0.2ml20盐水 2 ml盐水 2 ml盐水 2 ml1血清 0.2ml160对照管盐水0.5ml盐水0.5ml盐水0.5ml盐水0.5ml第六管11血清 0.2ml血清 0.2ml4080第一排（TH）第二排（TO）第三排（PA）第四排（PB）血清稀释度0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第二管1：400.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第三管1：800.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第四管1：1600.5ml0.5ml0.5ml0.5ml第五管1：3206、加入诊断菌液：于第一排各管加入伤寒杆菌“H”菌液 0.5 毫升。于第二排各管加入伤寒杆菌“O”菌液0.5 毫升，于第三排各管加入甲型副伤寒“H”菌液0.5 毫升，于第四排各管加入乙型副伤寒“H”菌液 0.5 毫升，因此各管的血清最后稀释度为1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，液体总量为 1.0 毫升。7、将以上各管在试管架中充分振荡摇匀后放置 56水浴中 2-4 小时，取置室温中过夜-54-次日观察结果。结果观察方法：1、观察结果前不要振摇试管。2、先观察抗原对照管应无凝集，有时可见管底有圆形沉淀，但轻轻摇试管仍呈均匀混浊现象，如对照管有凝集，即表示抗原或盐水有问题。3、试验管应按顺序自第一管看起，先不要振摇，将试管举起，观察上面液体的清晰程度、及底部有无絮状凝块。然后轻摇试管、使凝块从底部升起，按液体的清浊，凝块的大小记录。4、“H”抗原凝集成絮状，疏松的凝块沉于管底，轻摇即随之升起，且易打碎；“O”抗原凝集呈颗粒状，沉于管底，成坚实聚块，轻摇则不易升起，凝集颗粒较小，不易打碎。5、凝集的强弱依试管上清液的清晰度与凝集颗 粒或絮状片的大小分别+、+、+、+、来作判定，其标准如下：上层液体管底凝块判定澄清透明大片絮状或大颗粒 +微混中等片或颗料 +微混絮片或颗粒较少仍可见 +混浊絮片或颗料似有似无 +混浊抗原沉于管底呈圆形块6、血清稀释度大，仍可有+凝集者为该血清的效价。7、解释结果时应注意以下各点：病人血清同时与伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌，乙型副伤寒杆菌液发生凝集时，应以效价最高者作为诊断标志，低者系类属凝集反应。凝集效价必须高于正常人的血清，有诊断价值。双份血清，第二份血清效价为第一份血清效价的4 倍或更高，有确诊意义。应结合患者病史及临床症状，参考“H”与“O”的效价做出正确的判定。8、正常值：TO1:80 TH1:160 PAH1:80 PBH1:40-55-实验十粪便中分离细菌的菌落观察，生化反应与血清学试验（综合性实验）Observation of isolation bacterium colony in stool、biochemical relation andserologic test一、菌落观察在 SS 琼脂和 E、M、B 琼脂培养基上，如检查的沙门氏菌或痢疾杆菌，则选取平板上无色半透明光滑湿润边缘整齐的圆形菌落。而非致病菌，如大肠杆菌在 SS 琼脂培养基上则是红色的菌落，在 EMB 培养基上则是紫黑色并带有金属光泽的菌落。二、生化反应与其结果的观察在培养基上选择无色半透明较小的可疑菌落，取单个可疑菌落的一半接种半固体双糖