纤维素酶活测定.pdf

word 专业资料-可复制编辑-欢迎下载【实验目的】1、学会并掌握用 3、5二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计【实验材料】1、3、5二硝基水杨酸显色液；2、05%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用 0.1mol/LPH4.5 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；3、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）。【实验步骤】1、标准曲线的绘制：分别吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 的葡萄糖于 5 支试管中,均用蒸馏水稀释至 1mL,加 3.5-二硝基水杨酸显色剂 3mL,在沸水浴中煮沸显色 10 分钟,冷却,定容至 25ml.以 1 毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至 25ml。在 550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线（见表一）。2、空白管的测定：取 1 毫升酶液,沸水浴 5 分钟，冷却加 3 毫升 0.5%CMC，与样品管同时放入 50 度水浴 30 分钟。其它操作同样品管。3、样品的测定：取 0.5%羧甲基纤维素钠溶液 3 毫升，酶液 1 毫升,于 50 度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液，冷却加入3毫升显色液，再沸水浴 10 分钟，冷却后加水定容至 25 毫升，混匀，550nm 测 OD 值（见表二）。实验结果：见表一、表二：表一 标准曲线的测定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 显色液/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 沸水浴中煮沸显色 10min,冷却,加蒸馏水至 25mL word 专业资料-可复制编辑-欢迎下载 A(550)0.000 0.135 0.294 0.456 0.605 0.727 表二 样品的测定 编号 空白 样品一 样品二 样品三 酶液/mL 1(失活)1 1 1 CMC/mL 3 3 3 3 50恒温 30min 显色液/mL 3 3 3 3 沸水浴中煮沸显色 10min,冷却,加蒸馏水至 25mL A(550nm)0.000 0483 0.480 0.484 图一：标准葡萄糖光吸收曲线 word 专业资料-可复制编辑-欢迎下载 结果分析：拟合所得的标准曲线为：Y=7.43910-4X-0.00243。拟合度为 0.99917。由样品的 A 值，可得三份溶液的葡萄糖含量分别为：652.5ug，648.5ug，653.9ug。所以平均含量：651.6ug。纤维素酶活力单位=651.6/0.0130=2172 ug/mgmin【思考与讨论】1、在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致。2、在测溶液的 OD 值之前，应将溶液摇匀，摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口，然后来回震荡试管。