实验三细菌纯种分离培养和接种技术.pdf
实验三实验三 细菌纯种分离、培养和接种技术细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的一、实验目的1 了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义;2 学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法;3 学习和掌握水中大肠菌群的检测方法;二、实验原理二、实验原理水的微生物学的检验,特别是肠道细菌的检验,在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义,同时也是评价水质状况的重要指标;国家饮用水标准规定,饮用水中大肠菌群数每升中不超过 3 个,细菌总数每 mL 不超过 100 个;它反映的是检样中活菌的数量;所谓大肠菌群,是指在 3724h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称;水的大肠菌群数是指 100mL 水检样内含有的大肠菌群实际数值,以大肠菌群最近似数 MPN 表示;水源中大肠菌群的数量,是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标;目前,国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标;因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查;水中大肠菌群的检验方法,常用多管发酵法和滤膜法;多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长;滤膜法仅适用于自来水和深井水,操作简单、快速,但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样;三、实验材料三、实验材料1、菌落总数的测定：1 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,无菌生理盐水;2 器材：灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等;2、大肠菌群的测定：1 培养基：乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨 20g,胆盐或牛、羊胆盐 5g,乳糖 10g,%溴甲酚紫水溶液 25mL,水 1000mL,;制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中,校正 pH,加入指示剂,分装,每瓶 50mL 或每管 5mL,并倒置放入一个杜氏小管,121灭菌 15min;伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中,校正 pH 后分装121灭菌 15min 备用;平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种;四、实验方法四、实验方法1、水样的采集：1 自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流 5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析;2 池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m 处,取距水面 10-15cm 的深层水样,先将灭菌的具塞三角瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出;如果不能在 2h 内检测的,需放入冰箱中保存;2、细菌总数的测定：1 水样稀释及培养：按无菌操作法,将水样作 10 倍系列稀释；根据对水样污染情况的估计,选择 2-3 个适宜稀释度饮用水如自来水、深井水等,一般选择 1、1:10 两种浓度；水源水如河水等,比较清洁的可选择 1:10、1:100、1:1000 三种稀释度；污染水被选择 1:100、1:1000、1:10000 三种稀释度,吸取 1mL 稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作 3 个重复;将熔化后保温度45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿,每皿约15mL,并趁热转动平皿混合均匀;待琼脂凝固后,将平皿倒置于 37培养箱内培养 241h 后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得 1mL 水样中所含的细菌菌落总数;2 计算方法：作平板计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏;在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数;3 计数的报告：选取菌落数在 30-300 之间的平板作为菌落总数测定标准;一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数;如果一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,可计算半个平板后乘 2 以代表整个平板的菌落数;细菌的菌落数在 l00 以内时,按其实有数报告；大于 100 时,用二位有效数字,在二位有效数字后面的数字,以四舍五入方法修约;为了缩短数字后面的 0 的个数,可用 10 的指数来表示;3、大肠菌群的测定多管发酵法：初步发酵试验：在 10 支装有 10mL 的乳糖胆盐的发酵试管中内有倒置小管,以无菌操作各加入稀释后的水样 1mL;摇匀后,37培养 24h;平板分离：经 24h 培养后,将产酸产气及只产酸的发酵管瓶,分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板 EMB培养基上,37培养 1824h;大肠菌群在 EMB 平板上,菌落呈紫黑色,具有或略带有或不带有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片,革兰氏染色,镜检;复发酵试验：将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中,为防止遗漏,每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落 13 个,37培养 24h,如果产酸又产气者,即证实有大肠菌群存在;五、实验结果五、实验结果1、自来水中细菌总数计算;2、湖水水样初发酵现象观察;
