第四章-荧光分析法-现代食品检测技术-教学课件.ppt

LOGOLOGO第一节第一节 概述概述一、分子发光一、分子发光 某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激某些物质的分子吸收一定能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射。发态后，在返回电子基态的过程中伴随有光辐射。二、分子发光类型二、分子发光类型1 1、按激发模式按激发模式光致发光光致发光 ：分子因吸收外来辐射的光子能量而被激：分子因吸收外来辐射的光子能量而被激 发所产生的发光现象。发所产生的发光现象。化学发光：分子的激发能量是由反应的化学能量提化学发光：分子的激发能量是由反应的化学能量提 供的发光现象。供的发光现象。LOGO生物发光：分子的激发能量是由生物体释放生物发光：分子的激发能量是由生物体释放出来的能量所提供所产生的发光现象。出来的能量所提供所产生的发光现象。2 2、按分子激发态的类型来划分、按分子激发态的类型来划分荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射 跃迁而伴随的发光现象。跃迁而伴随的发光现象。磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐 射跃迁而伴随的发光现象。射跃迁而伴随的发光现象。LOGO第二节第二节 分子荧光分析法及其基本原理分子荧光分析法及其基本原理 一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基基态态(S S0 0)激激发发态态(S S1 1、S S2 2、激激发发态态振振动动能能级级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S S1 1、S S2 2 ；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T T1 1、T T2 2 ；LOGOLOGO3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛预振动弛预无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光：荧光：1010-7-71010-9-9s,s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：1010-4-41010s s；第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；LOGO（1）无辐射能量传递过程）无辐射能量传递过程振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式 由高振动能级至低相邻振动能级间由高振动能级至低相邻振动能级间 的跃迁。的跃迁。1010-12-12s s。内转换：同多重态电子能级中内转换：同多重态电子能级中,等能级间的无辐等能级间的无辐 射能级交换。射能级交换。1010-11-11s s1010-13-13s s 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。子跃回第一激发单重态的最低振动能级。LOGO外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生 相互作用而转移能量的非辐射跃迁；相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或猝灭。外转换使荧光或磷光减弱或猝灭。系间跨越：不同多重态系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。非辐射跃迁。1010-2-2s s1010-6-6s s 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨轨道耦合进行。道耦合进行。LOGOLOGO磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动 能级能级基态（基态（T T1 1 S S0 0跃迁）；跃迁）；电子由电子由S S0 0进入进入T T1 1的可能过程：的可能过程：S S0 0T T1 1禁阻跃迁禁阻跃迁S S0 0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振振动弛豫动弛豫 T T1 1发光速度很慢：发光速度很慢：1010-4-4100 s 100 s。光照停止后，。光照停止后，可持续一段时间。可持续一段时间。LOGO（3 3）瑞利散射光和拉曼光）瑞利散射光和拉曼光瑞利散射光瑞利散射光 激发光的能量不足，将电子激发至基态中较高的振激发光的能量不足，将电子激发至基态中较高的振动能级，假如电子在受激后能量没有损失，并且在瞬动能级，假如电子在受激后能量没有损失，并且在瞬时返回原来的能级，于是便在各个不同的方向发射和时返回原来的能级，于是便在各个不同的方向发射和激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。激发光相同波长的辐射，这种辐射称为瑞利散射光。拉曼光拉曼光 被激发到基态中其它较高振动能级的电子，当它返被激发到基态中其它较高振动能级的电子，当它返回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着产生波长回到比原来的能级稍高或稍低时，便伴随着产生波长略长或略短于激发光波长的拉曼散射光。略长或略短于激发光波长的拉曼散射光。LOGOLOGO二、分子荧光分析的基本原理二、分子荧光分析的基本原理1 1、激发光谱与荧光、激发光谱与荧光(磷光磷光)光谱光谱（1 1）.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱的激发光谱 曲线曲线 固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发化合物发射的荧光射的荧光(磷光磷光)强度与照射光波长的关系曲强度与照射光波长的关系曲线线 （图中曲线（图中曲线I I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。最多，荧光强度最大。LOGOLOGOLOGO（3）.激发光谱激发光谱 与发射光谱与发射光谱 的关系的关系 .Stokes.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长（emem）比比激激发发光光谱谱的的波波长长（exex）长长，振振动弛豫消耗了能量。动弛豫消耗了能量。.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃跃迁迁回回到到基基态态，产产生生波波长长一一定定的的荧荧光。光。LOGOLOGO.镜像规则镜像规则 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能能级级分布类似；分布类似；基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的二二振振动动能能级级之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁也然迁也然。LOGO200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱LOGO2 2、荧光强度及其与浓度的关系荧光强度及其与浓度的关系（1 1）量子产率及影响因素）量子产率及影响因素 表示物质发射荧光的能力表示物质发射荧光的能力。=发射的光子数发射的光子数 /吸收的光子数吸收的光子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。由于有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。由于激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁，激发分子的去活化过程包括辐射跃迁和非辐射跃迁，因而荧光量子产率也可表示为：因而荧光量子产率也可表示为：=k=kf f/(k/(kf f+K)+K)k kf f：辐射跃迁速率，：辐射跃迁速率，K K：非辐射跃迁速率：非辐射跃迁速率LOGO（2 2）荧光强度与浓度的关系）荧光强度与浓度的关系 在稀溶液中（在稀溶液中（bcbc0.05)0.05)，荧光强度与荧光物质，荧光强度与荧光物质的的 浓度成正比。浓度成正比。I If f =2.3=2.3 I I0 0 bcbc 荧光强度荧光强度I If f正比于吸收的光量正比于吸收的光量I Ia a与荧光量子产率与荧光量子产率 。在一定条件下：在一定条件下：I If f =K c=K c 在浓溶液中，荧光强度常常随溶液浓度增加而下降在浓溶液中，荧光强度常常随溶液浓度增加而下降a a 因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大降低；降低；b.b.溶质与溶质间的相互作用产生荧光物质的激发态分溶质与溶质间的相互作用产生荧光物质的激发态分 子与基态分子形成复合物；子与基态分子形成复合物；c c 自吸收。自吸收。LOGO3.3.荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系（1 1）分子产生荧光必须具备两个条件：）分子产生荧光必须具备两个条件：a.a.具有合适的结构；具有合适的结构；b.b.具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。（2 2）化合物的结构与荧光）化合物的结构与荧光 共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率 并产生红移。并产生红移。a a 芳环越大芳环越大,荧光峰越移向长波方向荧光峰越移向长波方向 b b 同一共轭环数的芳族化合物同一共轭环数的芳族化合物,线性环结构者荧线性环结构者荧 光波长比非线性者要强。光波长比非线性者要强。LOGOLOGOb b 形成络合物后形成络合物后,形成刚性平面形成刚性平面 滂铬兰黑滂铬兰黑R R（BBRBBR）无荧光，它与铝形成螯合物有荧）无荧光，它与铝形成螯合物有荧光。光。LOGOc c 取代基之间形成氢键取代基之间形成氢键加强了分子刚性结构和增强荧光强度。加强了分子刚性结构和增强荧光强度。d d 异构体的影响异构体的影响 顺式和反式同分异构体具有不同的荧光强度。顺式和反式同分异构体具有不同的荧光强度。LOGO取代基效应取代基效应 芳环上有供电基，使荧光增强。芳环上有供电基，使荧光增强。a a 给电子基团常使荧光增强给电子基团常使荧光增强;取代基对苯荧光的影响取代基对苯荧光的影响(乙醇溶液乙醇溶液)化合物化合物 分子式分子式 荧光波长荧光波长(nm)(nm)荧光相对强度荧光相对强度 苯苯 C C6 6H H6 6 270310 10270310 10苯酚苯酚 C C6 6H H5 5OH 285365 18OH 285365 18苯胺苯胺 C C6 6H H5 5NHNH2 2 310405 20310405 20苯基氰苯基氰 C C6 6H H5 5CN 280390 20CN 280390 20苯甲醚苯甲醚 C C6 6H H5 5OCHOCH3 3 285345 20 285345 20 LOGOLOGO 跃迁类型跃迁类型 *的荧光效率高，系间跨越过程的速率的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。常数小，有利于荧光的产生。LOGOLOGOLOGO转入三重态猝灭转入三重态猝灭 发生发生S S1 1T T1 1间的系间窜跃，把多余的能量消间的系间窜跃，把多余的能量消耗于碰撞之中使荧光猝灭。耗于碰撞之中使荧光猝灭。（2 2）温度、酸度和溶剂的影响）温度、酸度和溶剂的影响温度温度 随着溶液温度的降低，荧光物质溶液的荧光随着溶液温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。量子产率和荧光强度将增大。酸度酸度 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pHpH的影响较大，需要严的影响较大，需要严格控制。格控制。LOGO 溶剂溶剂 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。（3 3）表面活性剂的影响）表面活性剂的影响 增溶增溶 增敏增敏a a 提高荧光量子产率提高荧光量子产率;b b 提高提高。增稳增稳LOGO第三节：荧光分析仪器第三节：荧光分析仪器 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测测量量)波波长长的的第第二二单单色色器；器；光光源源：灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染染料激光器料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)检测器：光电倍增管。检测器：光电倍增管。LOGO仪仪器器光光路路图图LOGO一、基本装置及主要构件一、基本装置及主要构件1 1、激发光源、激发光源 （1 1）条件）条件足够的强度足够的强度紫外，可见区域有连续的光谱紫外，可见区域有连续的光谱强度与波长无关强度与波长无关光强稳定光强稳定（2 2）激发光源）激发光源氙灯（高压）氙灯（高压）:250:250800nm800nm光谱区呈连续光谱，氙灯光谱区呈连续光谱，氙灯 使用寿命大约为使用寿命大约为2000h2000h。汞灯（高压）汞灯（高压）:在紫外区激发，在紫外区激发，365nm365nm，使用寿命，使用寿命 1500 150030003000小时。小时。LOGO2 2、单色器、单色器光栅单色器光栅单色器 有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱，有较高的灵敏度，较宽的波长范围，能扫描光谱，主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可主要缺点是杂散光较大，有不同级次的谱线干扰，可用前置滤光片加以消除。用前置滤光片加以消除。滤光片滤光片 滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有滤光片便宜简便，在荧光计和荧光分光光度计中有广泛的应用。广泛的应用。3 3、样品池、样品池 石英方形池，四面都透光。石英方形池，四面都透光。4 4、狭缝、狭缝 狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。狭缝越小，单色性越好，但光强和灵敏度降低。LOGO5 5、检测器、检测器光电倍增管：灵敏度高，线路简单。光电倍增管：灵敏度高，线路简单。光电摄像管：具有检测效率高，动态范围光电摄像管：具有检测效率高，动态范围 宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。宽，线性响应好，坚固耐用和寿命长特点。6 6、读出装置、读出装置 记录仪、阴极示波器和显示器。记录仪、阴极示波器和显示器。二、常用的一些荧光分光计二、常用的一些荧光分光计1 1、YF 1 YF 1 型荧光分光计型荧光分光计 手控式荧光分光计手控式荧光分光计 2 2、YF2YF2型荧光分光计型荧光分光计 自动记录式自动记录式3 3、微机化荧光分光计、微机化荧光分光计 970 CRT 970 CRT型荧光分光光度计；日立型荧光分光光度计；日立F2500 RF540 F2500 RF540 LOGO磷光检测磷光检测 荧荧光光计计上上配配上上磷磷光光测测量量附附件件即即可可对对磷磷光光进进行行测测量量。在在有有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。测量方法：测量方法：（1 1）通通常常借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命的的差差别别，采采用用磷磷光光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。（2 2）采采用用脉脉冲冲光光源源和和可可控控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。室室温温测测量量时时，不不需需要要杜瓦瓶。杜瓦瓶。LOGO第四节第四节 荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用一、荧光定量分析方法一、荧光定量分析方法定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 I If f正比于正比于吸收的光量吸收的光量I Ia a和荧光量子效率和荧光量子效率 ：I If f=I Ia a 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律：I Ia a=I I0 0(1-10(1-10-l c l c)I If f=I I0 0(1-10(1-10-l c l c)=)=I I0 0(1-(1-e e-2.3-2.3 l c l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：I If f =2.3=2.3 I I0 0 l cl c =KcKcLOGO1 1标准曲线法标准曲线法 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度荧光强度，在标准曲线上求出浓度2 2、比较法、比较法 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。度，比较。LOGO3 3、多组分混合物的荧光分析多组分混合物的荧光分析 各组分荧光峰相互不干扰，按单组分测定方法，分各组分荧光峰相互不干扰，按单组分测定方法，分 别在各自的荧光峰处测定；别在各自的荧光峰处测定；如果荧光峰互相干扰，激发光谱相差大，可选择在如果荧光峰互相干扰，激发光谱相差大，可选择在 不同的激发光进行测定，其它组分在此激发波长不不同的激发光进行测定，其它组分在此激发波长不 会产生荧光；（书会产生荧光；（书p114p114例）例）如果在同一激发波长下荧光光谱互相干扰，可以利如果在同一激发波长下荧光光谱互相干扰，可以利 用荧光强度的加和性，解联立方程求出。用荧光强度的加和性，解联立方程求出。LOGO4 4、荧光分析注意事项、荧光分析注意事项防止荧光污染防止荧光污染防止散射光的干扰防止散射光的干扰三、荧光分析法的特点三、荧光分析法的特点 1 1、灵敏度高；、灵敏度高；2 2、选择性强；、选择性强；3 3、重现性好；、重现性好；4 4、试样量少；、试样量少；5 5、应用范围小。、应用范围小。LOGO四、荧光分析法的应用四、荧光分析法的应用1 1 无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定2 2 生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表见表 LOGOLOGOLOGO3 3、食品检测方面应用、食品检测方面应用（1 1）食品中矿物质及金属元素的分析食品中矿物质及金属元素的分析（2 2）食品中氨基酸、维生素等的分析食品中氨基酸、维生素等的分析（3 3）食品霉变物质、菌类污染荧光分析食品霉变物质、菌类污染荧光分析（4 4）食品添加剂、防腐剂、食品包装有害物食品添加剂、防腐剂、食品包装有害物 质分析质分析（5 5）食品农药残留、药物残留分析食品农药残留、药物残留分析