第八章-病毒的一般研究方法与技术-病毒学课件.ppt

1第八章 病毒的一般研究方法与技术2p第一节 病毒培养 p第二节 病毒的分离纯化与测定 p第三节 病毒的鉴定3第一节 病毒培养 病毒培养在病毒学研究中除用做病毒增殖、病原分离以外，还用于研究病毒的复制过程及细胞的病理变化，研究病毒与宿主的互作关系，探讨抗体与抗病毒物质对病毒的作用方式与机制等。还可用于病毒的分离鉴定、抗原的制备、疫苗和干扰素的生产、病毒性疾病诊断和流行病学调查等。4一、活体培养p动物实验法是最原始的病毒培养方法。p常用实验动物有小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔、猴等。p根据不同病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉。(一)动物实验法6根据病毒的特性可分别接种在尿囊腔接种；羊膜腔接种；鸡胚绒毛尿囊膜接种；卵黄囊接种等等。78鸡胚培养优缺点 比用动物更加经济简便；鸡胚的组织分化程度低，病毒易于繁殖；鸡胚和实验动物一样，为正在发育中的机体，有神经血管的分布及脏器的结构；鸡胚来源充足，操作简便，本身很少带病毒，是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。p可能含有家禽病毒的母源抗体；可能携带垂直传播的病原体；很多病毒在鸡胚中不生长。p鸡胚常用于流感病毒、腮腺炎病毒等的分离培养。10(一)细胞培养病毒的优点p没有隐性感染：细胞培养来源于动物的部分组织，可通过预先检查组织避免隐性感染 p没有免疫力：离体培养的细胞无免疫力，可利于病毒的生长。p容易选择易感细胞：细胞来源方便，可选择最敏感的细胞以满足实验要求。p易于获得大量病毒：动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，而细胞不仅可以大量生产，还可持久地续培养。p培养条件易于控制：可用人工控制温度、气体、pH、培养基成分，大规模生产方式来生产细胞和病毒及其细胞产物。p提高了疫苗的产量和质量：细胞大量生产可满足疫苗产量的需求；可减少疫苗污染菌，随制随用，成本低，来源方便，便于储存，效力稳定，易标准化生产。p病毒分离容易：采用细胞培养可显著加速病毒的分离过程。11p199培养基(Eagle平衡盐溶液)几乎包含所有氨基酸、维生素及一些核酸中间代谢产物和辅助生长因子等，主要用于原代细胞的生长，使用时加上0.5%10%的胎牛血清，营养更丰富。pMEM培养基(带有Earle平衡盐溶液)含有对哺乳类细胞生长必需的最低限度的维生素和氨基酸，用于原代细胞的维持和生长。加10%胎牛血清，用于最初的细胞生长。加0.5%2%的胎牛血清可用于细胞的维持。pEBM培养基(用Earle平衡盐溶液配制的Eagle基础培养基)其中的氨基酸和维生素的含量均较MEM培养基有所增加，通常加上0.5%10%的FCS，用于二倍体或传代细胞的维持和生长。pLeibovltz 15培养液（L-15培养液)这是一种人工综合培养液，其中不加葡萄糖而用半乳糖作为能源，因此不需要CO2缓冲系统。此外，L-15培养液内含有过量的氨基酸，有些带有自由碱基，可长期维持细胞培养。(二)细胞培养基细胞培养基因细胞类型和细胞培养的用途不同而异。1315传代细胞 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如Hela、Hep-2、Vero细胞系等），染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。16第二节 病毒的分离纯化与测定 病毒的分离纯化与定量测定是病毒学研究的基本技术。通过病毒的分离纯化，可获得纯化的、有感染性的病毒制备物。通过病毒测定可确定病毒数量及活性。病毒分离是将疑有病毒而待分离的标本经处理后，接种于相应敏感的宿主、鸡胚或感染细胞，培养一段时间后，通过检查不同病毒的特异性表现确定病毒的存在，并对病毒进行提取和纯化。18病毒的接种 动物病毒标本可接种于实验动物、鸡胚和易感的培养细胞。植物病毒可接种于敏感的植物叶片。噬菌体标本可接种于生长在培养液或营养琼脂平板中的细菌培养物 标本接种于何种实验宿主(动物、植物、细菌、鸡胚、细胞)以及选择何种接种途径，主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性。19病毒的感染症状 n动物病毒感染敏感细胞培养能引起细胞病变效应（成团、肿大、圆缩、脱落、细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体）。n细胞单层培养上形成肉眼可见的局部病损区域，称蚀斑或空斑。20猴肾细胞猴肾细胞+poliovirus猴肾细胞+HSV21p植物病毒感染症状通常是叶片黄化、退绿、皱缩、卷曲，植株矮化、坏死；果实减少或畸形。p噬菌体感染症状表现为细菌培养液变清亮或在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬菌斑。22二、病毒的纯化 由于病毒只能在活细胞内繁殖，所以用于病毒制备的起始材料只能是病毒感染的宿主机体、组织或细胞经破碎后的抽提物，或病毒感染的宿主的体液、器官和分泌物，或病毒感染的细胞培养物的培养液等。这些材料中不可避免地混杂有大量的组织或细胞成分、培养基成分、可能污染的其他微生物与杂质。24病毒纯化的方法-差速离心n根据颗粒质量的差异，利用低速除去组织、细胞壁等比病毒质量大的杂质，利用高速除去上清液中比病毒质量小的可溶成分。n如要提高纯度，可再经12轮低速和超速差异离心。超速离心法不可能将病毒提得很纯，因为样品中常存在许多质量与病毒相近的颗粒。差速离心法无法除尽杂质，而且沉淀的病毒凝聚成块，很难分散悬浮。25病毒纯化的方法-密度梯度离心 蔗糖密度梯度离心法应用很广，提取的病毒纯度比较高；但难以分开某些与病毒密度相近的成分。如需得到更纯的病毒，需要进行氯化铯等密度梯度离心。26三、病毒的测定 病毒的测定是根据病毒的理化性质、感染性、免疫学性质等所进行的定量分析。感染性测定是依据病毒在宿主细胞内高速繁殖和随后释放感染性颗粒的能力，而免疫学测定则取决于病毒表面成分的特异性。28(二)病毒的感染性测定对感染性病毒颗粒数量的测定称为病毒感染性测定，它测定的是感染引起宿主或培养细胞某一特异性病理反应的病毒数量。2950%致死量（LD50）或50%组织细胞感染量（TCID50）+or 代表CPE细胞病理变化 31经典途径（抗体依赖）IgM抗体结合到入侵者上，补体蛋白聚集分子C1结合到IgM抗体的Fc区，两个C1能够结合同一个IgM抗体的Fc区，使复合物聚集到足够近，C1复合物的抑制剂脱离，从而在入侵者表面启动了补体C3转换酶级联反应。抗体区分入侵者，补体蛋白为清除者。重链的恒定区32中和试验：在活体或活细胞内测定病毒被特异性抗体中和、而失去致病力的试验。将稀释的抗血清和一定浓度的病毒混合，放置一段时间(放置时间依病毒而异)，做病毒感染力测定。有病毒特异的抗血清能中和病毒的感染能力，以此测定病毒的量。33免疫荧光：用荧光染料标记抗体，检测细胞内特异性病毒抗原以及追踪病毒抗原的位置。34其它免疫学测定方法p放射免疫吸附测定：放射活性的碘(126I)标记蛋白质上酪氨酸基团用于定量测定溶液中的特异抗原或抗体。p酶联免疫测定:用碱性磷酸酶或过氧化物酶来标记抗体，利用比色方法通过测定酶促反应产物间接测定被抗体固定了的抗原。p免疫扩散：利用琼脂凝胶使抗原抗体相互扩散，当抗原抗体相互作用产生复合物时产生一个明显的沉淀线。这个方法在检测病毒的多种抗原成分特别有用。p血凝试验：病毒的包膜蛋白能够在一定条件下凝集一定种类的动物红细胞，所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比。35第三节 病毒的鉴定 利用形态学、物理学、化学、生物学、免疫学、分子生物学方法等鉴定病毒的性质，描述病毒的特征，是病毒分类的前提。病毒鉴定也是诊断病毒性疾病的可靠方法。36一、根据病毒感染的宿主范围及感染症状鉴定 大多数病毒都有一定的宿主范围，因而病毒的宿主谱可以作为病毒初步鉴定的指标。病毒感染宿主机体所引起的疾病症状，在鸡胚绒毛尿囊膜上所形成的痘疱的形态以及细胞培养产生的致细胞病变效应都有一定特异性，根据这些特征性的表现可对病毒进行初步鉴定。37二、病毒的理化性质鉴定 利用电子显微镜技术、超速离心技术、分子生物学技术以及热、紫外线、化学药物、脂溶剂等理化因子对病毒感染性的影响，可检测病毒的形态大小、沉降系数、浮力密度、相对分子质量、核酸类型、对不同理化因子的敏感性等，给病毒鉴定提供重要的依据。38三、病毒的血细胞凝集性质鉴定 许多病毒能吸附于一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞表面产生凝集现象，不同的病毒所凝集的血细胞种类以及发生凝集所要求的温度、pH条件可能不同，这为病毒鉴定提供精确的依据。39四、病毒的血清学鉴定 建立在抗原与抗体特异性反应基础上的免疫学方法是一类非常重要的病毒鉴定方法。免疫沉淀反应、凝集反应、酶联免疫吸附测定、血凝抑制试验、中和试验、免疫荧光、免疫电镜、放射免疫、单克隆抗体等技术都广泛用于病毒鉴定工作。40五、病毒的分子生物学鉴定 运用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的肽图与N末端氨基酸分析、核酸的酶切图谱、序列测定、PCR等生物化学与分子生物学方法鉴定病毒核酸、蛋白质等组分的性质，为在分子水平上阐明病毒的性质，对其进行准确的分类鉴定提供了更为直接可靠的证据，而且对于病毒性疾病的诊断也具有特殊的意义。4142下节课再见了下节课再见了