遗传学第9章-基因操作-4h课件.ppt
第九章第九章 基因分析技术基因分析技术12本章重点重组重组DNADNA技术技术限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平/粘末端）粘末端）载体（载体（vectorvector）概念、条件、常用载体）概念、条件、常用载体克隆克隆(clone)(clone)的概念及主要步骤的概念及主要步骤PCRPCR概念、原理、步骤、应用概念、原理、步骤、应用分子杂交：分子杂交：探针的概念探针的概念探针标记方法探针标记方法:缺口平移法、随机引物法缺口平移法、随机引物法 Southern Blot:Southern Blot:原理、步骤、应用原理、步骤、应用 Northern BlotNorthern Blot：原理、步骤、应用：原理、步骤、应用DNADNA多态多态:RFLPRFLP，VNTRVNTR，STRSTR，微卫星，微卫星DNADNA3 20 20世纪世纪7070年代以来年代以来,依赖于分子遗传依赖于分子遗传学的进步，分子生物学技术迅速发展学的进步，分子生物学技术迅速发展,使使人类对人类基因组及单个基因的结构、人类对人类基因组及单个基因的结构、功能、变异的研究成为现实。本章就一功能、变异的研究成为现实。本章就一些常用基因工程相关的分子生物学技术些常用基因工程相关的分子生物学技术予以介绍。予以介绍。4 第一节第一节 重组重组DNA技术技术基因工程基因工程 重组重组DNADNA技术技术（RecombinantDNATechnique）人类根据需要选择目的基因（或人类根据需要选择目的基因（或DNA片段）在体外与片段）在体外与基因运载体基因运载体重组重组，转移至另一细胞或生物体内进行扩增、，转移至另一细胞或生物体内进行扩增、表达，得到大量相同的表达，得到大量相同的DNADNA片段片段或或表达相应的基因产物表达相应的基因产物，以以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。该技术的发展和应用，关键在于该技术的发展和应用，关键在于限制酶限制酶的发现和应用。的发现和应用。6一、限制酶和连接酶一、限制酶和连接酶特异性切断特异性切断DNA链中链中磷酸二酯键磷酸二酯键是重组是重组DNA等技术所需的一类等技术所需的一类重要工具酶。重要工具酶。发现于原核生物体内，现已分发现于原核生物体内，现已分离出离出100100多种。多种。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)“分子手术刀分子手术刀”71 1、限制酶的命名、限制酶的命名根据其来源命名。如：根据其来源命名。如：(coli)种名种名 菌株名菌株名(RY13)EcoRI(Escherichia)属名属名 编号编号EcoRI来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌E.coli的的RY13菌株菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。指在该菌株中分离的第一个限制酶。8不不同同限限制制酶酶切切割割产产生生的的限限制制性性片片段段 10互补末端连接互补末端连接11 若不同种限制性核酸内切酶识别序列各不相同若不同种限制性核酸内切酶识别序列各不相同,但切割后能产生相同的黏性但切割后能产生相同的黏性末端末端,则称为同尾酶。则称为同尾酶。如如BamH、Bcl、Bgl、Sau3A、Xho为一组同尾酶为一组同尾酶,它们的识别序它们的识别序列和切割位点依次分别是列和切割位点依次分别是5-GGATCC-35-TGATCA-35-AGATCT-35-CGATCN-35-AGATCN-3 它们切割它们切割DNA后都形成由后都形成由GATC组成的黏性末端组成的黏性末端.由同尾酶酶切产生的由同尾酶酶切产生的DNA片段片段,能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。能够通过黏性末端的互补作用而彼此连接起来。1319671967年在三个实验室同时发现年在三个实验室同时发现一种一种封闭封闭DNA链上缺口链上缺口的酶，借助的酶，借助ATP水解提供的能水解提供的能量催化量催化DNA链的链的5-PO4-与另一与另一DNA链的链的3-OH生成磷生成磷酸二酯键。酸二酯键。常用的常用的DNADNA连接酶有两种：连接酶有两种：来自来自大肠杆菌大肠杆菌的的DNA连接酶连接酶 来自来自噬菌体噬菌体的的T4DNA连接酶连接酶 经限制酶切割和经限制酶切割和DNA连接酶的作用，将靶连接酶的作用，将靶DNA序列和序列和载体载体DNA连接成重组连接成重组DNA分子。分子。4 4、DNADNA连接酶连接酶15二、基因运载体及其选择二、基因运载体及其选择 载体载体（Vector）:将外源目的将外源目的DNA导入受体细胞，导入受体细胞，并能自我复制增殖（和并能自我复制增殖（和/或表达）的工具。或表达）的工具。16根据载体根据载体用途用途分为：分为：克隆载体：克隆载体：外源外源DNA片段在宿主细胞中复制、片段在宿主细胞中复制、拷贝增多。载体上需有复制起始点。拷贝增多。载体上需有复制起始点。表达载体：表达载体：外源外源DNA片段或基因在宿主细胞中片段或基因在宿主细胞中表达产生蛋白质。载体上还需有启动子。表达产生蛋白质。载体上还需有启动子。常用的载体：常用的载体：质粒、质粒、噬菌体、粘粒噬菌体、粘粒 PI、BAC、YAC 用途和分类用途和分类18（一）质粒（一）质粒 Plasmid：独立于细菌染色体外的双链环状独立于细菌染色体外的双链环状DNA分子。分子。19天然质粒不易满足理想运载体的要求，多采用天然质粒不易满足理想运载体的要求，多采用人工改建质粒人工改建质粒。常用质粒：常用质粒：（原核）大肠杆菌质粒：如（原核）大肠杆菌质粒：如pUC19 20质粒载体：插入外源片段质粒载体：插入外源片段10kb10kb。具备特点：分子量较小，多克隆位点，抗性基因，复制起始具备特点：分子量较小，多克隆位点，抗性基因，复制起始点点21（二）（二）-噬菌体噬菌体(phage)一种可在体外包装的一种可在体外包装的细菌病细菌病毒，毒，可高效感染大肠杆菌。可高效感染大肠杆菌。特征特征:线状双链线状双链,全长约全长约5050kb。55末端是末端是1212bp突出的互补突出的互补粘末端，称粘末端，称COS序列序列。进入。进入宿主细胞后，宿主细胞后，COS序列碱基序列碱基配对环化。配对环化。22（三）粘粒（三）粘粒(cosmidvector)l将将质粒和质粒和噬菌体噬菌体改造改造的载体，改造后的载体，改造后含含含含噬噬菌体的菌体的COS序列以及质序列以及质粒粒（plasmid）特性特性l可携带片段：可携带片段：30-4530-45kbl多用于基因文库构建多用于基因文库构建24(四四)大片段大片段DNA克隆载体克隆载体 人类和哺乳动物许多单个基因相当大（如：人类和哺乳动物许多单个基因相当大（如：DMDgene 2300 2300kb），克隆、表达分析需更），克隆、表达分析需更大的基因载体。大的基因载体。近年来人工构建的一些载体：近年来人工构建的一些载体：P，BAC，YAC 等。等。251 1、噬菌体、噬菌体PP载体和载体和PAC PP噬菌体噬菌体:其其DNA为线性为线性 ，110110115115kb ，体外包装，体外包装于蛋白质壳内。于蛋白质壳内。PDNA进入宿主细胞后环化、扩增。进入宿主细胞后环化、扩增。携带外源携带外源DNA片段片段:70-100:70-100kbPAC:PAC:PP和和F F因子结合产生因子结合产生PP人工染色体克隆系统。人工染色体克隆系统。携带外源携带外源DNA片段片段:130-150:130-150kb26YAC的结构特征的结构特征 1 1）着丝粒：着丝粒：有丝分裂姊妹染色单体分离之必需。有丝分裂姊妹染色单体分离之必需。2 2）端粒：端粒：保护染色体末端免受核酸酶侵袭。保护染色体末端免受核酸酶侵袭。3 3）自主复制序列（自主复制序列（ARS）元件：）元件：染色体自主复制的起点。染色体自主复制的起点。与外源与外源DNA连接成线性连接成线性DNA分子，导入分子，导入酵母细胞酵母细胞克隆。克隆。携带外源携带外源DNA片段片段 ：0.2-20.2-2Mb3 3、酵母人工染色体、酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）282 2个端粒个端粒1 1个着丝粒个着丝粒1 1个自主复制个自主复制元件元件（ARS）29基本原理与主要步骤基本原理与主要步骤1.1.分离纯化目的基因分离纯化目的基因;2.2.构建重组构建重组DNA分子分子;3.3.宿主细胞的转化宿主细胞的转化;4.4.细胞克隆的选择性筛选细胞克隆的选择性筛选,筛选含有重组筛选含有重组DNA细胞细胞;5.5.分离重组分离重组DNA克隆。克隆。基本原理基本原理:将将DNA片段在体外重组并在适当的宿主细胞中增殖。片段在体外重组并在适当的宿主细胞中增殖。DNA克隆主要步骤：克隆主要步骤：311 1、分离纯化目的基因、分离纯化目的基因 从基因组中分离目的基因；从基因组中分离目的基因；由特定由特定mRNA逆转录合成逆转录合成cDNA；化学合成目的基因；化学合成目的基因；PCR体外扩增目的片段。体外扩增目的片段。322 2、构建重组、构建重组DNA分子分子:目的基因目的基因+载体载体33 重组的重组的DNA分子导分子导入特异宿主细胞的过入特异宿主细胞的过程称转化。程称转化。重组重组DNA分子导分子导入细菌后，随细菌繁入细菌后，随细菌繁殖不断复制和扩增，殖不断复制和扩增，最终得到大量相同拷最终得到大量相同拷贝的目的贝的目的DNA。3 3、宿主细胞的转化、宿主细胞的转化344、筛选含有重组、筛选含有重组DNA的细胞的细胞将转化的细胞置于琼脂表面，刺激细胞克隆生长，将转化的细胞置于琼脂表面，刺激细胞克隆生长，由单由单个细胞增殖形成遗传相同的细胞群体个细胞增殖形成遗传相同的细胞群体故称故称细胞克隆细胞克隆。将阳性的克隆移至将阳性的克隆移至液体培养基液体培养基中进行扩增。中进行扩增。5、分离重组、分离重组DNA克隆：克隆：收获扩增的培养细胞，并选择分离重组收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。35细胞克隆选择增殖细胞克隆选择增殖 36四、目的基因表达四、目的基因表达 将目的基因与将目的基因与表达载体表达载体重组，导入宿主细胞表达出相应基重组，导入宿主细胞表达出相应基因产物（蛋白）。因产物（蛋白）。获得基因重组后产物获得基因重组后产物蛋白质。蛋白质。如胰岛素、干扰素；生产疫苗的抗原等。此类克隆系统称如胰岛素、干扰素；生产疫苗的抗原等。此类克隆系统称表达克隆表达克隆（expressioncloning）。）。37目的基因表达目的基因表达 38（一）真核细胞基因在原核细胞（细菌）中表达（一）真核细胞基因在原核细胞（细菌）中表达真核多肽的表达要求：真核多肽的表达要求：1 1）适当的）适当的cDNA（完整的编码序列），提供特定多肽信息；（完整的编码序列），提供特定多肽信息；2 2）适当的表达载体。）适当的表达载体。产物特征：产物特征：1 1）原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，）原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子剪接因子等），不能有效地进行翻译后修饰而不稳定；等），不能有效地进行翻译后修饰而不稳定；2 2）活性受限或无活性。）活性受限或无活性。39（二）真核细胞基因在真核细胞中表达（二）真核细胞基因在真核细胞中表达 真核细胞如真核细胞如酵母酵母或或昆虫昆虫细胞细胞作为宿主细胞作为宿主细胞,提供一个相似提供一个相似但又不相同的基因表达环境。但又不相同的基因表达环境。产物特点产物特点:具有翻译后加工如具有翻译后加工如糖基化等糖基化等有利于蛋白的稳定有利于蛋白的稳定和功能活性和功能活性。应用：应用：大量制备真核细胞蛋大量制备真核细胞蛋白质，白质，研究特定基因表达。研究特定基因表达。40五、基因文库五、基因文库(DNA文库文库)DNA文库文库（DNAlibrary)：指通过指通过DNA克隆克隆(重组重组)技术技术人工构建的包含人工构建的包含某一特定来源某一特定来源DNA所有片段的重组所有片段的重组DNA克隆总和。克隆总和。DNADNA来源来源不同：可构建不同的不同：可构建不同的DNA文库。文库。1.1.基因组基因组DNA文库文库2.2.染色体特异的基因文库染色体特异的基因文库3.3.cDNA文库文库（cDNAlibrary）41基因组基因组DNA文库文库:应用应用DNA重组技术重组技术构建的含有基因组构建的含有基因组全部全部DNA序列的序列的DNA克克克克隆总和。隆总和。DNA来源：人类几乎来源：人类几乎所有所有细胞的核基因组细胞的核基因组DNA相同，可用相同，可用易得到的外周血细胞易得到的外周血细胞DNA制备基因组制备基因组DNA文库。文库。用途：该文库包含人类所有用途：该文库包含人类所有DNA序列。用核酸杂交技术从序列。用核酸杂交技术从中筛查和分离目的基因。中筛查和分离目的基因。42构建基因组构建基因组DNA文库文库43筛查含有目的基因的细胞克隆筛查含有目的基因的细胞克隆44染色体特异的基因文库染色体特异的基因文库（chromosomespecificlibrary）单个染色体单个染色体 细胞克隆细胞克隆 （流式（流式细胞细胞仪）仪）细胞细胞 染色体染色体 染色体染色体DNA文库文库 染色体区带染色体区带 区带特异区带特异 (显微切割）显微切割）DNA文库文库 45 cDNA文库文库（cDNAlibrary）材料来源：材料来源：特定特定组组织细胞织细胞一定发育阶一定发育阶段段总总RNA。46第二节第二节 分子杂交及相关技术分子杂交及相关技术 分子杂交分子杂交（molecularhybridization）核酸核酸分子杂交分子杂交 蛋白蛋白分子杂交分子杂交 WesternBlot：检测蛋白质：检测蛋白质SouthernBlot ：检测：检测DNANorthernBlot ：检测：检测RNA47 核酸分子杂交核酸分子杂交（Nucleicacidmolecularhybridization）标记的核酸探针变性后与变性的靶标记的核酸探针变性后与变性的靶DNA/RNA通过碱基通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。互补配对结合，形成杂种分子的过程。其目的是鉴定分析复杂的靶其目的是鉴定分析复杂的靶DNA/RNA中与探针同源的核中与探针同源的核酸片段。酸片段。双链双链DNA变性（解链）主要取决于：变性（解链）主要取决于：1 1链的长度：链的长度：链越长，解链需要的能量越多。链越长，解链需要的能量越多。2 2碱基成分：碱基成分：GC含量高，较难变性。含量高，较难变性。3 3化学环境：化学环境：单价阳离子稳定双链；单价阳离子稳定双链；甲酰胺、尿素破坏双链。甲酰胺、尿素破坏双链。48一、基因探针一、基因探针（geneprobe）基因探针基因探针（geneprobe):是指一段与目的基因或是指一段与目的基因或DNA/RNA片段片段特异互补的核苷酸序列。特异互补的核苷酸序列。可以是整个基因，或是基因的一部分；可以是整个基因，或是基因的一部分；可以是可以是DNA，也可以是，也可以是RNA。49（一）探针的种类与制备（一）探针的种类与制备 1 1、基因组探针：、基因组探针：从已建立的基因组文从已建立的基因组文库中筛选和分离所需库中筛选和分离所需目的基因。目的基因。克隆克隆 扩增扩增 大量的大量的DNA探针也可探针也可用用PCR方法合成。方法合成。502 2、cDNA探针探针:从已构建的从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因，文库中筛查和分离目的基因，也可用也可用RT-PCR方法合成。方法合成。3 3、寡核苷酸探针、寡核苷酸探针:根据已知基因序列合成一段互补的根据已知基因序列合成一段互补的DNA片段。一片段。一般长约般长约15-5015-50个个bp。51（二）探针的标记（二）探针的标记 将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的常用于标记探针的标识物标识物：同位素：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；等；非同位素：地高辛非同位素：地高辛-dNTP ，生物素，生物素-dNTP。标记方法：标记方法：1 1、缺口平移法、缺口平移法 2 2、随机引物法、随机引物法 3 3、DNA末端标记法：利用末端标记法：利用多聚核苷酸激酶用多聚核苷酸激酶用32P 置换置换5端磷酸或将端磷酸或将32P添到酶切后的添到酶切后的5黏性末端。黏性末端。52缺口平移法缺口平移法（NickTranslation）原理及过程原理及过程：反应体系中反应体系中DNA酶酶I随机在探针随机在探针DNADNA上打开缺口；上打开缺口；DNA聚合酶聚合酶I具有具有53外切酶活性外切酶活性，在缺口处按，在缺口处按53方向切方向切除单核苷酸；除单核苷酸；DNA聚合酶聚合酶I还具有还具有53聚合酶活性聚合酶活性，在缺口处，在缺口处3端加入底物端加入底物中单核苷酸，弥补缺口处核苷酸链。中单核苷酸，弥补缺口处核苷酸链。随反应进行，底物中被标记单核苷酸随机掺入。随反应进行，底物中被标记单核苷酸随机掺入。DNA聚合酶聚合酶I两种作用交替进行，探针即被标记。两种作用交替进行，探针即被标记。53NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶酶I，DNA聚合酶聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP54随机引物法（六核苷酸引物标记法）随机引物法（六核苷酸引物标记法）原理及过程：原理及过程：利用利用E.coliDNA聚合酶聚合酶I的的Klenow亚单位亚单位，合成含有标记核，合成含有标记核苷酸的苷酸的DNA链。链。Klenow具有具有53聚合酶活性。聚合酶活性。待标记待标记DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow酶催化下，按酶催化下，按53方向合成方向合成DNA新链。新链。反应体系中含有标记的反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成随机掺入新合成DNA链中，探链中，探针被标记。针被标记。55随机引物标记探针随机引物标记探针53553DNA32p-dNTP,Bio-dNTP6bpprimerKlenow,dNTP变性变性复性复性56（一）（一）SouthernBlot（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（三）（三）NorthernBlot二、核酸杂交常用的方法二、核酸杂交常用的方法57（一）（一）Southernblot1975年，英国科学家年，英国科学家Southern首创，是检测首创，是检测DNA的经典方法。的经典方法。1、原理原理：碱基互补碱基互补(DNA-DNA)2、步骤步骤：:提取组织或细胞提取组织或细胞DNA限制酶消化限制酶消化DNA片段片段电泳分离电泳分离变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜标记探针、变性、杂交标记探针、变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析58-+SouthernblotSouthernblot探针探针探针探针593、应、应用用遗传学研究及临床基因诊断等遗传学研究及临床基因诊断等(1)基因组结构分析：基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测如缺失、插入、倒位等的检测(2)DNA多态检测：多态检测：RFLP连锁分析等连锁分析等60（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleotide,ASO）适用于基因突变部位和性质已完全明确。适用于基因突变部位和性质已完全明确。合成合成ASOASO探针，大小探针，大小20bp20bp左右，标记后用于杂交检测。左右，标记后用于杂交检测。检测检测点突变点突变时一般需设计合成两种探针：时一般需设计合成两种探针：正常探针正常探针 5 5-A-AG GT-3T-3 只与只与正常正常基因序列杂交形成稳定杂交体基因序列杂交形成稳定杂交体 突变探针突变探针 5 5-A-AA AT-3T-3 只与只与突变突变基因序列杂交形成稳定杂交体基因序列杂交形成稳定杂交体PCRPCR技术可结合技术可结合ASOASO，即，即PCR-ASOPCR-ASO技术，以技术，以ASOASO探针检探针检测扩增后产物测扩增后产物突变基因检测。突变基因检测。61例例:PKU产前诊断产前诊断2进行产前基因诊断进行产前基因诊断结果分析结果分析2为正常个体为正常个体正常探针正常探针突变探针突变探针121262（三）（三）Northernblot 检测检测RNA分子分子，应用特异性基因探针分析基因，应用特异性基因探针分析基因转录水平。转录水平。1、原理：、原理：碱基互补配对碱基互补配对2、步骤：、步骤：提取组织或细胞总提取组织或细胞总RNA提纯分离提纯分离mRNA琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离RNA转移至尼龙膜转移至尼龙膜杂交检测杂交检测63NorthernBlot643、应用、应用（1）检测）检测mRNA分子量大小分子量大小（依电泳迁移率估计）（依电泳迁移率估计）（2）检测）检测mRNA的含量的含量，即基因表达水平高低（密，即基因表达水平高低（密度扫描仪，定量分析）度扫描仪，定量分析）65三、三、Westernblot 蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理：原理：抗原抗体特异性结合。抗原抗体特异性结合。抗原抗体反应抗原抗体反应步骤：步骤：组织或细胞组织或细胞提取蛋白提取蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白转移（印迹）于膜上转移（印迹）于膜上加抗体检测某种特异性蛋白质加抗体检测某种特异性蛋白质66WesternBlot67四、生物芯片技术四、生物芯片技术生物芯片，包括生物芯片，包括DNA芯片芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。是一种微型多参数生物传感器。在一微小固体载体表面固定大量的等。是一种微型多参数生物传感器。在一微小固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物、蛋白质、分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其他生物组分准确，快速、大量地筛选或检测。核酸、细胞或其他生物组分准确，快速、大量地筛选或检测。基因芯片基因芯片（又称（又称DNA芯片，芯片，DNA微列阵）微列阵），它集成了大量密集排列的基因探针，它集成了大量密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能同配对，实现核酸序列的分子识别。能同时分析大量基因，实现生物基因信息的时分析大量基因，实现生物基因信息的大规模检测。大规模检测。6869基因芯片的应用基因芯片的应用基因组扫描基因组扫描 基因型及单碱基多态性（基因型及单碱基多态性（SNPSNP）突变检测突变检测基因功能研究基因功能研究 基因表达分析等基因表达分析等7071五、聚合酶链反应五、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）概念：概念：模拟体内模拟体内DNA复制复制条件，应用条件，应用DNA聚合酶反聚合酶反应，应，体外体外程序化地特异性程序化地特异性扩增某一扩增某一DNA片段的技术。片段的技术。KaryB.MullisKaryB.Mullis72PCR737474原理：原理：模拟体内模拟体内DNA复制条件复制条件步骤：步骤：1）合成与待扩增区域两端已知）合成与待扩增区域两端已知DNA序列互补的特异性寡核苷序列互补的特异性寡核苷酸引物。引物序列决定扩增片段酸引物。引物序列决定扩增片段特异性特异性及及长度长度。2）反应体系：）反应体系：DNA模板，模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，聚合酶，buffer，引物，去离子水，引物，去离子水3）反应程序：）反应程序：变性变性9495oC复性复性延伸延伸5065oC7072oC72oC延伸延伸10min30个循环，个循环，DNA扩增扩增100万倍万倍75PCR扩增扩增76PCR特点及应用特点及应用特点：特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快速。）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快速。（2）微量的模板）微量的模板DNA即可扩增大量产物。即可扩增大量产物。应用：应用：生命科学生命科学疾病诊断疾病诊断法医学法医学考古学等考古学等缺点缺点：（：（1）产物片段较短。）产物片段较短。（2）DNA复制不精确。复制不精确。77在同一在同一PCR体系中加入数对体系中加入数对PCR引物，引物要求：引物，引物要求：引物退火温度相近引物退火温度相近所覆盖区域不重叠所覆盖区域不重叠扩增片段长度不同扩增片段长度不同可可同时同时扩增扩增多个多个DNA片段，并可经电泳分离检测。片段，并可经电泳分离检测。应用：应用：检测同一基因多个外显子缺失检测同一基因多个外显子缺失检测缺失时设置内对照。检测缺失时设置内对照。1、多重、多重PCR六、六、PCR相关技术相关技术78792、RT-PCR以以mRNA为模板，经逆转录合成为模板，经逆转录合成cDNA，再以特异性引物进行再以特异性引物进行PCR扩增。扩增。优点：优点：微量微量mRNA（pg水平）迅速扩增（达水平）迅速扩增（达ngug水平），大大提高水平），大大提高mRNA检出灵敏度。检出灵敏度。应用应用:检测基因表达水平，属于半定量检测。检测基因表达水平，属于半定量检测。80RT-PCR81七、单链构象多态性七、单链构象多态性（SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP）原理原理:单链单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，该由于碱基序列不同可引起构象差异，该差异使相同或相近长度的单链差异使相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。电泳迁移率不同。与与PCR技术联合应用，称为技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。技术。应用：应用：DNA中中单个单个碱基替代、碱基替代、微小微小缺失或插入检测。缺失或插入检测。82过程：过程：1、在疑有突变的、在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物；片段附近设计一对引物；2、进行、进行PCR扩增扩增3、产物经、产物经甲酰胺甲酰胺等变性，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中等变性，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶）。性胶）。4、突变分析：突变引起、突变分析：突变引起DNA构象差异表现为电泳带位置构象差异表现为电泳带位置的差异的差异。83PCR-SSCP过程过程 -primer-32P-dNTP掺入掺入PCR扩增扩增产物产物变性变性单链单链DNA中性中性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳12345自显影自显影 结果分析结果分析 解链解链构像构像DNA原原理理过过程程84人类基质修复基因人类基质修复基因NEIL1突变突变85第三节第三节DNA多态多态DNA多态（多态（DNAPolymorphism）在一个群体中存在由遗传决定的两种或两种以上的基因在一个群体中存在由遗传决定的两种或两种以上的基因型型，其，其中频率最低的形式也远远高于依赖突变所能维持的频率。对于中频率最低的形式也远远高于依赖突变所能维持的频率。对于同一基因座上的两个或两个以上的等位基因，等位基因频率至同一基因座上的两个或两个以上的等位基因，等位基因频率至少为少为0.01,携带该等位基因的杂合子的频率大于携带该等位基因的杂合子的频率大于2%，认为该基因，认为该基因座具有多态性，称座具有多态性，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。遗传分析中的标记。除一卵双生子外，没有两个个体的基因组除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。是完全相同的。突变与多态：突变与多态：86DNA分析中常用的多态性标记分析中常用的多态性标记1）第一代多态性标记）第一代多态性标记:限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（RFLP）；）；2）第二代多态性标记）第二代多态性标记:重复序列多态性（重复序列多态性（VNTR）、）、短串联重复序列（短串联重复序列（STR）；）；3）第三代多态性标记：）第三代多态性标记：单碱基多态性（单碱基多态性（SNP），），为为DNA序列的单个核苷酸的差别。序列的单个核苷酸的差别。87一、限制性片段长度多态性一、限制性片段长度多态性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP）由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切在用同一限制酶切割时，产生不同长度的割时，产生不同长度的DNA片段，称片段，称RFLP。RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。的遗传标记。88AlleleII酶切位点消失酶切位点消失 RFLPSouthernblot检测结果检测结果89二、数目变异串联重复二、数目变异串联重复（variablenumbertandemrepeats,VNTR）重复序列以各自的重复序列以各自的核心序列核心序列（重复单元），首尾（重复单元），首尾相连相连多次重复多次重复，称为串联重复序列，其重复次数，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即在人群中存在变异，形成多态即VNTR。散在分布于染色体上。散在分布于染色体上。重复单位重复单位625bp长，长，称为小卫星称为小卫星DNA。重复单位重复单位26bp长，如（长，如（TA）n,(CGG)n等，等，称称为微卫星为微卫星DNA。90VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以通过多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增后电泳来检出，称扩增扩增片段长度多态片段长度多态（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）大大小小91PCR-VNTR检测检测92PCR-VNTR93三、三、SNP基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态序列多态94MTHFR 多态多态(C667T)PCR-RFLP分析结果，多态可被分析结果，多态可被Hinf I酶切识别。酶切识别。C等位基因酶切后片段为等位基因酶切后片段为400bp，T等位基因酶切后片段为等位基因酶切后片段为318bp和和82bpA:MTHFRRFLP结果结果B、C:MTHFR 677CC和和 677TT测序测序95本章重点重组重组DNADNA技术技术限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平/粘末端）粘末端）载体（载体（vectorvector）概念、条件、常用载体）概念、条件、常用载体克隆克隆(clone)(clone)的概念及主要步骤的概念及主要步骤PCRPCR概念、原理、步骤、应用概念、原理、步骤、应用分子杂交：分子杂交：探针的概念探针的概念探针标记方法探针标记方法:缺口平移法、随机引物法缺口平移法、随机引物法 Southern Blot:Southern Blot:原理、步骤、应用原理、步骤、应用 Northern BlotNorthern Blot：原理、步骤、应用：原理、步骤、应用DNADNA多态多态:RFLPRFLP，VNTRVNTR，STRSTR，微卫星，微卫星DNADNA96
