第二章--研究方法-细胞生物学课件.ppt

樊 庆 杰第一节 显微技术n n显微镜是观察细胞的主要工具。显微镜是观察细胞的主要工具。n n根据光源不同，可分为根据光源不同，可分为光学显微镜光学显微镜和和电子显微镜电子显微镜两大两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。后者则以电子束为光源。第二章 研究方法第二章 研究方法一、光学显微镜n n普通光学显微镜普通光学显微镜n n荧光显微镜荧光显微镜n n激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜n n暗视野显微镜暗视野显微镜n n相差显微镜相差显微镜NEXT普通光学显微镜普通光学显微镜n n普通生物显微镜由普通生物显微镜由3 3 部分构成，即：部分构成，即：照明系统照明系统，包，包括光源和聚光器；括光源和聚光器；光学放大系统光学放大系统，由物镜和目镜组，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；物镜都由复杂的透镜组构成；机械装置机械装置，用于固定，用于固定材料和观察。材料和观察。n n显微镜物象是否清楚不仅决定于显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数放大倍数，还与显微，还与显微镜的分辨力（镜的分辨力（resolutionresolution）有关。有关。分辨力分辨力是指显微镜是指显微镜（或人的眼睛距目标（或人的眼睛距目标2525cm cm 处）能分辨物体最小间隔的处）能分辨物体最小间隔的能力。能力。激光共聚焦扫描显微镜n n激光共聚焦扫描显微镜用激激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。逐面快速扫描成像。n n统经一次调焦，扫描限制在统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深样品的一个平面内。调焦深度不一样时，能显示细胞样度不一样时，能显示细胞样品的立体结构。品的立体结构。暗视野显微镜n n暗视野显微镜（暗视野显微镜（dark field microscopedark field microscope）的聚光镜中央有的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。物体的边缘是亮的。n n利用这种显微镜能见到小至利用这种显微镜能见到小至42004200nm nm 的微粒子，分辨的微粒子，分辨率可比普通显微镜高率可比普通显微镜高50 50 倍。倍。相差显微镜n n相差显微镜（相差显微镜（phasecontrast microscopephasecontrast microscope）由由P PZernike Zernike 于于19321932年发明，并因此获年发明，并因此获1953 1953 年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。n n这种显微镜最大的特点是这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和可以观察未经染色的标本和活细胞。活细胞。二、电子显微镜n n扫描电子显微镜扫描电子显微镜n n在光学显微镜下扫描电子显微镜（在光学显微镜下扫描电子显微镜（scanning electron scanning electron microscopemicroscope，SEMSEM）于于20 20 世纪世纪60 60 年代问世，用来观察年代问世，用来观察标本的表面结构。标本的表面结构。n n其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本的表面结构。的表面结构。三、显微操作技术n n显微操作技术（显微操作技术（micromanipulation techniquemicromanipulation technique）是指在是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。胚胎操作的一种方法。n n显微操作器显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。动的机械装置。n n显微操作技术包括显微操作技术包括细胞核移植细胞核移植、显微注射显微注射、嵌合体技嵌合体技术术、胚胎移植胚胎移植以及以及显微切割显微切割等。等。二、显微光谱分析技术n n细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。n n例如，核酸的吸收波长为例如，核酸的吸收波长为260260nmnm，而蛋白质的则为而蛋白质的则为280280nmnm。有的成分经组织化学染色后，对可见光有特有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。定的吸收光谱。n n根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光微分光光度计度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。第三节 细胞分离技术一、离心技术一、离心技术n n离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。微体，以及各种大分子基本手段。n n一般认为，转速为一般认为，转速为10251025Kr/min Kr/min 的离心机称为高速离心的离心机称为高速离心机；转速超过机；转速超过2525Kr/minKr/min，离心力大于离心力大于8989KgKg者称为超速者称为超速离心机。离心机。第二章 研究方法第二章 研究方法（一）、差速离心n n在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。n n速度沉降速度沉降 主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。n n等密度沉降等密度沉降 适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。二、细胞电泳n n在一定在一定PH PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（电泳（cell electrophoresiscell electrophoresis）。）。n n各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的 电位。电位。第四节 细胞培养与细胞融合一、细胞培养一、细胞培养n n高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外培养进行观察和研难的。但是如果把活细胞拿到体外培养进行观察和研究，则要方便得多。究，则要方便得多。n n所以所以细胞培养技术细胞培养技术（cell culturecell culture）就是选用最佳生存条就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。件对活细胞进行培养和研究的技术。第二章 研究方法第二章 研究方法Now,Have a rest!同学们，再见！