WATERS公司的UPLCTQD培训资料MS7校正课件.ppt
2008WatersCorporation12008WatersCorporation四极杆系统的校正四极杆系统的校正四极杆系统的校正四极杆系统的校正2008WatersCorporation2校正校正校正校正 硬件硬件硬件硬件 vsvs 软件软件软件软件硬件的校正是由原厂和维修工程师进行的，可以保证名义质量数的准度。对于某些应用，硬件校正是足够的。对于需要最高的质量准确度的情况，用户可以通过Masslynx软件进行软件校正，并将系统的质量校正变得更为精确。在识别未知物以及MRM和SIR分析时，确认选择了准确的质量数，这是非常有用的。2008WatersCorporation3校正中的可变因素校正中的可变因素校正中的可变因素校正中的可变因素环境的改变温度或者湿度的改变随着时间变化而发生的电源变化改变了分辨率设置改变了分辨率设置在仪器的校正范围内工作是非常重要的!如同您不愿意在定量曲线之外进行定量计算一样，您也不希望在您的质量数校正曲线之外工作。2008WatersCorporation4仪器的校正曲线（仪器的校正曲线（仪器的校正曲线（仪器的校正曲线（Calibration CurvesCalibration Curves）一台三重四极杆的仪器需要有三种校正曲线：对于MS1和MS2,有六条校正曲线静态校正（Staticcalibration）可以使四极杆质量分析器准确地定位于感兴趣的特定质量数上。(例如调谐，SIR和MRM).扫描校正（Scanningcalibration）保证在扫描采集中峰采集的质量数准确性。(例如全扫描FullScan).扫描速度补偿（Scanspeedcompensationcalibration）：当仪器快速扫描是，补偿系统中的“滞后时间”。质谱仪的每一种校正都需要参考溶液。不过，MassLynx可以在一个步骤中执行所有必须的校正。2008WatersCorporation5校正步骤校正步骤校正步骤校正步骤每个参考溶液的质谱图都是已经采集好的。采集过的质谱图中的峰与储存于参考文件表格中的预期理论质量数相匹配。Amassspectrumofareferencesolutionisacquired.ThepeaksintheacquiredspectrumarematchedagainstatableofexpectedtheoreticalmasseswhicharestoredinaReferenceFile.参考文件中的每一个峰与采集的质谱图中对应的峰相匹配。EachpeakintheReferenceFileismatchedtoacorrespondingpeakintheacquiredspectrumfile.Acalibrationcurveiscreatedthatadjuststhemassesoftheexperimantalspectralpeakstothetheoreticalmassesofpeaksaslistedinthereferencefile.一般注射泵TypicallyaSyringePumpcapableofdeliveringaslow,steadyflowrateof5or10L/minisusedwithanInfusionKitconsistingofafusedsilicacapillarytubingwithappropriatefittings.2008WatersCorporation6参考溶液（参考溶液（参考溶液（参考溶液（Reference SolutionsReference Solutions）参考溶液用于在一个宽mass范围内产生多离子。质谱仪可以在此范围内被校正。常用的参考溶液:PEG,PPGNaI/CsI,NaI/RbIHorseMyoglobin,PolyAlanine在此章节的最后有一些常用的参考溶液的配制方法。2008WatersCorporation7参考文件参考文件参考文件参考文件Reference FileReference File参考文件中包括参考溶液产生的质谱峰的信息，Masslynx软件将在校正过程中对其进行搜索并匹配之。该文件既有mass（m/z）信息，也有这些峰预期的强度。强度信息在校正LC/MS系统时，通常是不用的。参考文件置于Masslynx软件的Ref文件夹下。参比文件都是text文本文件，可以用Notepad写字板浏览之。参比文件必须具备一个“.ref”的扩展名。2008WatersCorporation8MS MS 校正的方式校正的方式校正的方式校正的方式从调谐页面进入，选择校正仪器校正使用自动调谐中的校正功能对于SQD、TQD，可以使用IntelliStartInstrumentSetup功能进行仪器校正2008WatersCorporation9校正仪器校正仪器校正仪器校正仪器Calibrate InstrumentCalibrate Instrument2008WatersCorporation10校正窗口校正窗口校正窗口校正窗口 2008WatersCorporation11校正的参考文件校正的参考文件校正的参考文件校正的参考文件Examples ofCalibration Reference Files -Myo.refMyo1500.refMyo1500n.refMyoneg.refMyotrp.refPigb.refNaics.refNaics1.refNaics2.refNaics3.refNaics4.refNaineg.refNairb.refPegh.refPegh1000.refPegh2000.refpeghna.refpeghnam.refpeghnh4.refppghna.refppghnh4.refHorseMyoglobinand PigNaI withCs or RbPEG or PPGCalibration Reference Files Are Stored in:C:MASSLYNXREF2008WatersCorporation12Note:Na+=22.9898Cs+=132.9054I-=126.9045Na(NaI)+=173Na(NaI)2+=322Na(NaI)3+=472校正的参考文件校正的参考文件校正的参考文件校正的参考文件2008WatersCorporation13NaINaI 参考溶液的特性参考溶液的特性参考溶液的特性参考溶液的特性 NaI基质的溶液有Na、I的优势，并有单一同位素。系统不必区分来自于不同同位素的各组峰。solutionshavetheadvantageofsodiumandiodinebeingmonoisotopic.Therearenosetsofmultiplepeaksfromdifferentisotopesthatthesystemhastodifferentiatebetween.使用NaI/RbI溶液校正低于85amu，使用NaI/CsI溶液校正低于133amu时，存在问题。Theremaybeaproblemwithcalibratingbelow85amuwithNaI/RbIand133amuwithNaI/CsI.完成了校正，在将所有的NaI清除出系统之前，可以看到ESP-的灵敏度降低，同时ESP+可以看到一系列Na的加合物YoumayseeadecreaseofsensitivityinnegativeESPandincreasedformationofsodiumadductsinpositiveESPrightafteryoucalibratetillalloftheNaIwashesoutofyoursystem.NaI溶液生成的离子可以高达4000amu。2008WatersCorporation14Magnified by 450XMagnified by 5XNaINaI RbIRbI 质谱图质谱图质谱图质谱图2008WatersCorporation15PEG/PPG PEG/PPG 参考溶液的特性参考溶液的特性参考溶液的特性参考溶液的特性PEG/PPG基质的溶液形成来源于不同同位素(主要是C)的多个峰。这些同位素峰组可以检查质谱仪的分辨率。PEG/PPG溶液非常容易电离。PEG(或者PPG)的混合物可以在一个宽质量数范围内产生离子(高达2500)。PEG/PPG溶液产生的碎片可以用于形成离子低至50amu之下。PEG/PPG可能变得很“粘稠”，清洗出系统可能需要一些时间。在确定的条件下，PEG/PPG溶液可以产生一系列的多电荷离子，也可以产生一系列的单电荷离子。这些系列可以交叠并导致在一定质量数范围内的校正困难。2008WatersCorporation16PEG 1000 PEG 1000 质谱图实例质谱图实例质谱图实例质谱图实例2008WatersCorporation17单电荷的铵加合物双电荷的铵加合物PEG 1000 PEG 1000 和醋酸铵和醋酸铵和醋酸铵和醋酸铵2008WatersCorporation18马心肌红蛋白（马心肌红蛋白（马心肌红蛋白（马心肌红蛋白（Myoglobin/PigBMyoglobin/PigB）参考溶）参考溶）参考溶）参考溶液的特性液的特性液的特性液的特性当分析蛋白和多肽时，质谱仪常常测定多电荷离子的m/z.对于一些化合物，电荷状态可以轻易地多达50。当校正分析多电荷离子的四极杆系统时，校正通常是在能产生多电荷离子的校正溶液基础上进行的。Whencalibratingquadrupolesystemsthatareanalyzingmultiplychargedspecies,thecalibrationisoftenperformedonareferencesolutionthatproducesmultiplychargedions.这类应用中的参考溶液的代表是马心肌红蛋白以及猪和/或牛血清蛋白。2008WatersCorporation1917151413121110918851816192021222324多电荷化合物的质谱图多电荷化合物的质谱图多电荷化合物的质谱图多电荷化合物的质谱图2008WatersCorporation20Mass Mass 校正概述校正概述校正概述校正概述选择并准备参考溶液（referencesolution）。设置针/泵（syringe/pump）与正确的源。清除现有的任何软件校正。对质谱仪进行调谐，找到参考溶液最佳灵敏度的参数。检查Mass校正中用到的参数。开始mass校正步骤。必要时，查看并编辑校正。2008WatersCorporation21The Calibration Uncal.cal should be a blank calibration(no software calibration)which you can load in(use“File/Open”menu item).未校正的参考文件未校正的参考文件未校正的参考文件未校正的参考文件UncalibratedUncalibrated Reference FileReference File2008WatersCorporation22清除当前的校正清除当前的校正清除当前的校正清除当前的校正 2008WatersCorporation23选择一个参考文件选择一个参考文件选择一个参考文件选择一个参考文件 2008WatersCorporation24质量分析器的设置质量分析器的设置质量分析器的设置质量分析器的设置2008WatersCorporation25质谱仪的调谐质谱仪的调谐质谱仪的调谐质谱仪的调谐2008WatersCorporation26设置峰显示的参数设置峰显示的参数设置峰显示的参数设置峰显示的参数从校正范围内选择四个代表性的峰并输入到Mass一栏中。确认选择了计划校正范围的顶端和底端的质量数。Makesureyoucheckamassnearthetopandbottomofthemassrangeoverwhichyouplantocalibrate.对于每一个峰，设置范围（Span）大约为5。确认选择了质谱上信号最弱的峰2008WatersCorporation27峰优化峰优化峰优化峰优化针对四个峰，尽可能地优化毛细管和锥孔电压。记住针对一个峰的绝对优化条件也许会完全消除另一个峰此处的目标是找出符合四个峰的条件。同时也要检查参考溶液中强度最大的峰，以此确认系统并未被饱和。2008WatersCorporation28编辑参考文件编辑参考文件编辑参考文件编辑参考文件Editing the Reference FileEditing the Reference File如果您不能找到某一个峰，它们可以通过在峰前面添加一个“；”而加以注释。在校正步骤中，将不使用此标示出的峰。确认保存了(File,Save)参考文件。如果标识出了特定的峰，保存尤其重要。2008WatersCorporation29AutoCalAutoCal Check Parameters Check Parameters2008WatersCorporation30校正参数校正参数校正参数校正参数Calibration ParametersCalibration Parameters2008WatersCorporation31Quad Mass Measure ParametersQuad Mass Measure Parameters2008WatersCorporation32开始校正采集开始校正采集开始校正采集开始校正采集Start Calibration Start Calibration AcquisitionAcquisition2008WatersCorporation33采集参数采集参数采集参数采集参数Acquisition ParametersAcquisition Parameters2008WatersCorporation34针对静态校正针对静态校正针对扫描速度补偿针对扫描速度补偿针对针对scan校正校正采集参数采集参数采集参数采集参数Acquisition ParametersAcquisition Parameters2008WatersCorporation35Acquiring for CalibrationAcquiring for CalibrationAfteralltheparameters(massrange,runduration,etc.)areentered,ClickOK andyouwillreturntowindowshowntotheright.ThisbringsyoubacktotheAutomaticCalibrationwindow(showntotheright),ClickOKtobeginacquisition2008WatersCorporation36Monitoring the AcquisitionMonitoring the Acquisition一旦校正采集开始，可以从此窗口监测校正过程。每当一个校正完成，每一阶段都会显示状态（pass/fail）。2008WatersCorporation37检查校正文件检查校正文件检查校正文件检查校正文件如果你选择了“打印报告”（PrintReport）选项，Masslynx将在校正完成后打印一份有所有校正的报告。检查报告，查看校正是怎样进行的，报告包括：采集的质谱图AcquiredSpectrum参考峰的质量数ReferencePeakMasses采集的峰与校正线之间的偏差。Deviationsoftheacquiredpeaksfromthecalibrationline.2008WatersCorporation38采集的谱图参比峰的质量数采集的峰与校正线之间的偏差打印出的校正报告的实例打印出的校正报告的实例打印出的校正报告的实例打印出的校正报告的实例2008WatersCorporation39Acquisition of Spectra for Acquisition of Spectra for CalibrationCalibration针对每一个校正类型，质谱图都采集并存放在一个后缀是.raw的文件中。质谱文件名o静态Static:StaticMS1=StatMS1.rawStaticMS2=StatMS2.rawo扫描Scanning:ScanningMS1=ScnMS1.rawScanningMS2=ScnMS2.rawo扫描速度补偿ScanSpeedCompensation:ScanSpeedCompensationMS1=FastMS1.rawScanSpeedCompensationMS2=FastMS2.raw2008WatersCorporation40ScanningCalibrationScan SpeedCompensation校正中采集的质谱图实例校正中采集的质谱图实例校正中采集的质谱图实例校正中采集的质谱图实例 2008WatersCorporation41对于静态校正，质谱图只采集每一个峰附近较小的质量范围。对于652峰，质谱图只测定648至657Da的范围From a Static Calibration校正质谱图校正质谱图校正质谱图校正质谱图2008WatersCorporation42质量范围质量范围 分辨率分辨率 离子能量离子能量慢和快的扫描速度慢和快的扫描速度检查校正检查校正检查校正检查校正2008WatersCorporation43回顾校正报告回顾校正报告回顾校正报告回顾校正报告 2008WatersCorporation44回顾校正报告回顾校正报告回顾校正报告回顾校正报告查看曲线:1)选择校正类型(Static,Scanning,ScanSpeedCompensation)以及四极杆(MS1orMS2)2)可以用BrowseIn浏览选择相应的文件:3)点击OK随后出现校正报告。2008WatersCorporation45回顾校正文件回顾校正文件回顾校正文件回顾校正文件 2008WatersCorporation46编辑校正编辑校正编辑校正编辑校正有时选择峰会出错，如此例所示.鼠标右键点击并托拽到感兴趣的峰上，可以编辑并手工选择正确的峰。2008WatersCorporation47编辑校正编辑校正编辑校正编辑校正选择了错误的峰错误的峰取消选择选择正确的峰2008WatersCorporation48保存校正保存校正保存校正保存校正2008WatersCorporation49校验校正校验校正校验校正校验校正校正结果也可以被校验。Withthecalibrationthatistobeverifiedinplaceonthemassspectrometer,usethesamesetupasthatusedforthecalibration.注意应该使用同样的分辨率和离子能量。从采集对话框中，选择Acquire&Verify选项，并点击OK。2008WatersCorporation50Verifying a CalibrationVerifying a CalibrationSpectrawillbeacquiredandpeakmassescomparedagainstreferencefilemassesjustlikeinthecalibrationprocedure.Themassdifferenceswillbereportedtoseehowgoodthecurrentcalibrationis.Thespectraacquiredfortheverificationprocesswillbestoredusingslightlydifferentfilenames.Static:oStaticMS1=StatMS1V.rawoStaticMS2=StatMS2V.rawScanning:oScanningMS1=ScnMS1V.rawoScanningMS2=ScnMS2V.rawScanSpeedCompensation:oScanSpeedCompensationMS1=FastMS1V.rawoScanSpeedCompensationMS2=FastMS2V.raw2008WatersCorporation51查看校正验证查看校正验证查看校正验证查看校正验证Reviewing a Calibration Reviewing a Calibration VerificationVerification需要时可以查看每种校正的验证，从Ifitisnecessarytoreviewthecurvesforeachtypeofverification,thenfromthewindowmenu,clickonProcess,VerificationFromFileandbrowseintheappropriatefile.(SimilartoreviewingacalibrationasshowninStep16b.)2008WatersCorporation52Verification ReportVerification ReportAThetopgraphshowsthepeaksfoundintheinfusedreferencesolution.ThemiddlegraphshowstheReferenceFilepeaks.Thelowergraphshowsthedifferencebetweenthemassfound(acquiredusingthecalibratedsystem)andthemassintheReferenceFile.Themassdifferencesshouldbelessthan0.1amu.2008WatersCorporation53保存校正质谱图保存校正质谱图保存校正质谱图保存校正质谱图Saving Calibration Saving Calibration SpectraSpectraThecalibrationspectrumdatafilesareoverwritteneverytimeacalibrationisperformed.Saveormovethecalibrationdatafoldersoffintoanotherfolderforlateruseifneeded.Forexample,youcanloadUncalandpracticechangingthemassmeasureparameters.ThenchoosetheRecalibrateFromFileoptionandselectoneofyoursavedfiles.2008WatersCorporation54AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation55AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation56AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation57AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation58AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation59AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation60AutoTune Wizard CalibrationAutoTune Wizard Calibration2008WatersCorporation61Calibrate CheckCalibrate Check2008WatersCorporation62PEG 1000 with Ammonium AcetatePEG 1000 with Ammonium Acetate2008WatersCorporation63Sodium Iodide Solution for Positive Sodium Iodide Solution for Positive Ion Ion ElectrosprayElectrosprayPrepareasolutionofsodiumiodideataconcentrationof:2g/L(micrograms/microliter)(2mg/mL)in50:50propran2ol(IPA)/waterwithnoadditionalacidorbuffer.Addcesiumiodidetoaconcentrationof0.05g/L(micrograms/microliter)(0.05mg/mL).oCesiumiodideistoobtainapeakatm/z133(Cs+).Withoutthis,thereisagapinthecalibrationfileof150amufromm/z23(Na+)andthefirstclusteratm/z173,whichleadstopoormasscalibrationinthismassrange.DonotaddmoreCsIthansuggested,asitcanresultinamorecomplexspectrumduetotheformationofNaCsIclusters.Usereferencefile:NAICS.REF2008WatersCorporation64Sodium Iodide Solution for Positive Sodium Iodide Solution for Positive Ion Ion ElectrosprayElectrospray(Alternative)(Alternative)Prepareasolutionofsodiumiodide,asdescribedpreviously,butinsteadofaddingcesiumiodide,userubidiumiodideataconcentrationof0.05g/L(micrograms/microliter)(0.05mg/mL).Thisgivesareferencepeakatm/z85(85Rb)withanintensityofapproximately10%ofthebasepeakatm/z173.oTheadvantageofRubidiumIodideisthatrubidiumclustersarenotformed,whichcancomplicatethespectrum.Usereferencefile:NAIRB.REF2008WatersCorporation65Calibration SolutionsCalibration SolutionsPEGsolutionforpositiveionelectrosprayandAPCIPrepareasolutionofthefollowingpolyethyleneglycolsin50:50acetonitrile/0.002Mammoniumacetateinwater(50:50ACN/2mMNH4AcetateinWater).oPEG200at25ng/L,PEG400at50ng/LoPEG600at75ng/LoPEG1000at250ng/LThisproducesaseriesofPEG+ammoniumionsallowingcalibrationuptoapproximately1200amu.Tocalibratefurtherupthemassscale,addPEG1500orpreferablyuseasodiumiodidesolution.Usereferencefile:PEGNH4.REF2008WatersCorporation66Calibration SolutionsCalibration SolutionsHorseheartmyoglobinforpositiveionelectrosprayForusewhenmeasuringlargemultiplychargedproteins,preparea5Msolutionofhorseheartmyoglobinin0.1%formicacidin50/50water/acetonitrile.Usereferencefile:MYO.REF
