CCK8检测细胞增殖毒性的原理及注意事项.pdf
CCK8CCK8 检测细胞增殖检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项毒性的原理、方法及注意事项一一、CCK8CCK8检检测测细细胞胞增增殖殖/毒毒性性的的原原理理Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理基本原理为：该试剂中含有 WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用途用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8CCK8 的优点的优点：使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；CCK-8 法能快速检测；CCK-8 法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；CCK-8 法的重复性优于 MTT 法；CCK-8 法对细胞毒性小；CCK-8 细胞活性检测试剂中为 1 瓶溶液，毋需预制，即开即用。CCK8CCK8 的缺点的缺点：与 MTT 法相比，CCK8 和 XTT 的价格比较贵。CCK8 试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。与以往的增殖与以往的增殖/毒性测定试剂相比较毒性测定试剂相比较：检测方法检测方法MTTMTT 法法XTTXTT 法法WST1WST1 法法CCK8CCK8 法法好好甲甲 臢臢 产产 物物 差（需加有 好的水溶性的水溶性机 溶 剂 溶解）产品性状产品性状使用方法使用方法粉末2 瓶溶液溶液即开即用1 瓶溶液即开即用配成溶液后 现配现用使用检检 测测 灵灵 敏敏 高度度检测时间检测时间检测波长检测波长细胞毒性细胞毒性较长很高很高高较短较短最短560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm高，细胞形 很低，细胞 很低，细胞 很低，细胞态完全消失 形态不变形态不变一般形态不变很好试试 剂剂 稳稳 定定 一般较差性性批批 量量 样样 品品 可以检测检测便捷程度便捷程度一般便捷便捷非常便捷非常适合非常适合非常适合二、二、CCK8CCK8 检测细胞增殖检测细胞增殖/毒性的方法毒性的方法实验一：细胞增殖分析实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液，同样的样本可做 3 个重复。3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10%CCK8 的培养基，以换液的形式加入。5、培养 1-4 小时:细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 小时）。6、测定 450nm 吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长 600-650nm。实验二：细胞毒性分析实验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液，同样的样本可做 3 个重复。3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质5、37培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养 1-4 小时:细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 小时）。8、测定 450nm 吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长 600-650nm。注：若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 L 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。三、三、CCK8CCK8 检测细胞增殖检测细胞增殖/毒性的注意事项毒性的注意事项当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔(100 l 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔(100 l 培养基)。酚红和血清对 CCK8 法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。CCK8 可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。CCK-8 在 0-5下能够保存至少 6 个月，在-20下避光可以保存 1 年。当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。在培养基中加入 CCK8，培养一定的时间，测定450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入 CCK8，培养一定的时间，测定 450nm 的吸光度作为空白对照。金属对 CCK-8 显色有影响：当终浓度为1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100%抑制。悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
