DB15_T 2833-2022 狼源性成分检测 实时荧光PCR法.docx

DB15/T 28332022狼源性成分检测 实时荧光 PCR 法1范围本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于动物源性产品（肉制品、皮毛制品、饲料等）中狼源性成分的鉴定，灵敏度为0.15ng/mL。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光PCR real-time PCR在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trithyl ammonium bromide)DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR:聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）TAMRA: 羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane5试剂与材料1DB15/T 28332022水：符合 GB/T 6682 的要求。引物对序列:a)  上游：5-CCGTACTCTAGCTTACATA-3；b)  下游：5-GAGACCTTCCAGATGAAA-3；c)  探针序列：5-(FAM)- TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA -(TAMRA)-3。DNA 提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl (pH 8.0 )。NaCl。EDTA。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。实时荧光 PCR 预混液。阳性对照样品：采用已知含有狼源性成分样品的 DNA，或经测序确认的阳性质粒。见附录 B。阴性对照样品：采用已知不含有狼（包括其他犬科动物）源性成分样品的 DNA。空白对照：ddH2O。6仪器与设备实时荧光 PCR 仪（加热速率 10 /s 以上）。高速台式离心机（最高转速 12000 rpm）。旋涡振荡器（最高转速 3000 rpm）。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平（感量 0.01 g）。单孔道微量移液器：0.5 mL10 mL、10 mL100 mL、20 mL200 mL、100 mL1000 mL。7实验方法DNA 提取参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA，也可采用等效商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A260 /A280在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性及空白提取对照。实时荧光 PCR 检测7.2.1反应体系反应体系体积为25.0 mL，见表1。2试剂名称贮备液浓度mmol/L反应体系体积mLPCR 反应预混合液12.5上游引物（F）10.01.0下游引物（R）10.01.0探针（P）10.01.0模板2.0ddH2O补足至总体积为 25.0DB15/T 28332022表1狼源性成分实时荧光 PCR 检测方法的反应体系检测过程分别设阴性对照、阳性对照和空白提取对照。7.2.2反应条件预变性：94 ，3 min；变性： 94 ，10 s；延伸退火：60 ，10 s，35个循环。在60 时收集荧光信号值。8结果判定与表述质量控制质控对照应满足以下条件，否则应重新实验：a)  空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于等于 35.0；b)  阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于等于 35.0；c)  阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 28.0。结果判定8.2.1质控对照成立条件下，2 个平行样检测结果 Ct 值大于 28.0，可判定被检样品为阴性。8.2.2质控对照成立条件下，2 个平行样检测结果 Ct 值小于等于 28.0，可判定被检样品为阳性。8.2.3质控对照成立条件下，至少 1 个平行样检测结果 Ct 值 28.035.0，并出现典型的扩增曲线，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。再次检测结果仍然 Ct 值小于等于 28.0，并出现典型的扩增曲线，可判定被检样品为阳性；再次检测结果 Ct 值大于 28.0，可判定被检样品为阴性。结果表述8.3.1结果为阳性者，表述为“检出狼源性成分”。8.3.2结果为阴性者，表述为“未检出狼源性成分”。9防止交叉污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。3DB15/T 28332022A                    A附录A（资料性）溶液配制及提取方法A.1CTAB-提取缓冲液将5 g CTAB，20.45 g NaCl，3.03 g Tris，1.86 g Na2-EDTA溶于200 mL水中，用盐酸调pH 8.0后，定容至250 mL，115 高压15 min。A.2CTAB-沉淀液称0.2 g CTAB,0.234 g NaCl，定容至100 mL，115 高压15 min。A.31.2 mol/L NaCl 溶液：称取28 g NaCl，定容至400 mL，115 高压15 min。A.4DNA 提取方法：A.4.1称取样品0.5 g1 g加入1.5 mL3.5 mL CTAB提取液中，再加入12 mL20 mL蛋白酶K（根据CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白提取对照。混匀后65 至少1 h(过夜孵育最好)，如样品膨胀，则可再多加CTAB,每次多1 mL，最多10 mL。A.4.24000 rpm/min5000 r/min离心10 min。A.4.3将上清（约1 mL）加入无菌EP中（2 mL管），加入700 mL氯仿，涡旋30 s后，再12000 rpm离心10 min。A.4.4取上清600 mL650 mL加入无菌EP管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1min。A.4.512000 rpm离心10 min，去上清。沉淀溶解于350 mL的1.2 mol/L NaCl溶液。（2管合并共用350mL溶液）。A.4.6加入350 mL氯仿，涡旋30 min， 12000 rpm离心10 min。A.4.7取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20 min，12000 rpm离心10 min，去上清，沉淀用500 mL 75%的乙醇洗涤，再12000 rpm离心10 min。A.4.8去上清后，干燥沉淀，60 下15 s20 s（开盖倒立）。A.4.9将沉淀溶于100 mL灭菌水或TE buffer或DEPC水中。4DB15/T 28332022B                    B附录B（规范性）狼源性成分的目标扩增序列 142 bpCCGTACTCTAGCTTACATAACTCAGGAAGGTGGGTACCTCACATTAGCCAAGAAGCCATTTTAGTCTTGGTGTCTGAAGGTGGGGTGGCTGGAAATTTC GTAGAAAGAATTTTTATATCTGCATTTCATCTGGAAGGTCTC5