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常用分子生物学技术的原理及应用你现在浏览的是第一页，共123页第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecularhybridization&blottingtechnology你现在浏览的是第二页，共123页核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化化双双链链的这种现象的这种现象。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理杂交的原理实质杂交的原理实质是核酸分子的是核酸分子的变性与复性变性与复性过程过程你现在浏览的是第三页，共123页复性复性RNADNA你现在浏览的是第四页，共123页（一）印迹技术（一）印迹技术1.具体步骤具体步骤SouthernE1975年首次应用年首次应用SouthernEM.DetectionofspecificsequencesamongDNAfragmentsseparatedbygelelectrophoresis.J Mol Biol，1975,98(3):503-517.原始文献出处：原始文献出处：你现在浏览的是第五页，共123页（一）印迹技术（一）印迹技术1.具体步骤具体步骤SouthernE1975年首次应用年首次应用琼脂糖分离的琼脂糖分离的DNA片段片段变性为单链变性为单链将一张将一张NC膜放在胶上，上面放吸水纸巾膜放在胶上，上面放吸水纸巾利用利用毛细作用毛细作用使胶中的使胶中的DNA片段转移到片段转移到NC膜膜上，使之成为上，使之成为固相化分子固相化分子。载有载有DNA单链分子的单链分子的NC膜可在杂交液与膜可在杂交液与另一种另一种DNA或或RNA分子（探针）分子（探针）杂交杂交，具有互，具有互补序列的补序列的RNA或或DNA结合结合到存在于到存在于NC膜的膜的DNA分子上，经检测分析可分子上，经检测分析可显现显现出杂交分子的出杂交分子的区带区带。你现在浏览的是第六页，共123页2.印迹印迹(blotting)定义定义将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。或直接放在固相化介质上并加以检测分析的技术。3.应用应用广泛用于广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测、蛋白质的检测4.发展发展电转移印迹技术、电转移印迹技术、真空吸引转移印迹等真空吸引转移印迹等你现在浏览的是第七页，共123页（二）探针技术（二）探针技术探针探针(probe)的概念的概念是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或荧光是带有特殊可检测标记（放射性核素、生物素或荧光染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核染料）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可以用来检测核酸样品中是否存在酸片段互补结合，因此可以用来检测核酸样品中是否存在某一特定的基因。某一特定的基因。探针的种类探针的种类n寡核苷酸探针寡核苷酸探针n基因组基因组DNA探针探针ncDNA探针探针nRNA探针探针你现在浏览的是第八页，共123页将探针与固定在将探针与固定在NC膜上的膜上的DNA或或RNA进行进行结结合合反应，探针的序列如与反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影放射自显影或或其其他检测手段他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。存在。探针技术的概念探针技术的概念你现在浏览的是第九页，共123页二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southernblotting)（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northernblotting)（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)你现在浏览的是第十页，共123页（一）（一）SouthernblottingM1 2转移缓冲液转移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜你现在浏览的是第十一页，共123页基因组基因组DNA的定性与定量分析。的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。重组质粒和噬菌体的分析。Southertblotting用途用途你现在浏览的是第十二页，共123页放放射射自自显显影影照照片片你现在浏览的是第十三页，共123页（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northernblotting)相同点：相同点：AlwineJC,et al.MethodfordetectionofspecificRNAsinagarosegelsbytransfertodiazobenzyloxymethyl-paper（重氮苄氧甲基纸）andhybridizationwithDNAprobes.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(12):5350-5354原始文献出处原始文献出处名称相对于名称相对于Southern blotting转移的是转移的是RNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法不同点不同点原理均为毛细作用。原理均为毛细作用。你现在浏览的是第十四页，共123页（二）（二）RNA印迹技术印迹技术Northernblotting用途用途检测某一组织或细胞中已知的特异检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。的表达水平。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。你现在浏览的是第十五页，共123页Northernblotting结果结果你现在浏览的是第十六页，共123页由于基因组测序的完成由于基因组测序的完成及基因芯片技术的成熟及基因芯片技术的成熟以上两种技术应用的越以上两种技术应用的越来越少来越少你现在浏览的是第十七页，共123页（三）蛋白质的印迹技术（三）蛋白质的印迹技术(免疫印迹免疫印迹)首先将混合蛋白质用首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小按分子大小分开，再将蛋白质转移到分开，再将蛋白质转移到NC膜或膜或PVDF膜上，膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。与与DNA和和RNA印迹相似之处印迹相似之处你现在浏览的是第十八页，共123页n蛋白质的转移只有靠电转移。蛋白质的转移只有靠电转移。n蛋白质的检测以蛋白质的检测以抗体抗体作探针。作探针。n用碱性用碱性磷酸酶（磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，）标记第二抗体，底物显底物显色色来检测来检测蛋白区带的信号，底物亦可与蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂化学发光剂结合以提高敏感度。结合以提高敏感度。n或用同位素标记第二抗体，或用同位素标记第二抗体，放射自显影法放射自显影法检测蛋白区带的信号。检测蛋白区带的信号。与与DNA和和RNA印迹不同之处印迹不同之处你现在浏览的是第十九页，共123页Westernblotting应用应用检测样品中的特异蛋白质的存在。检测样品中的特异蛋白质的存在。细胞中特异蛋白质的定量分析。细胞中特异蛋白质的定量分析。蛋白质分子的相互作用研究。蛋白质分子的相互作用研究。你现在浏览的是第二十页，共123页你现在浏览的是第二十一页，共123页你现在浏览的是第二十二页，共123页你现在浏览的是第二十三页，共123页辣根过氧化酶（辣根过氧化酶（HRP）使试剂中的发光物（）使试剂中的发光物（Luminol鲁米诺）氧化并发光，而试剂中含有增鲁米诺）氧化并发光，而试剂中含有增强剂这使得发光增强了强剂这使得发光增强了1000倍。经倍。经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）反应。标记的抗体与膜上的蛋白直接（标记一抗）反应。当加入免疫印迹化学发光试剂后，当加入免疫印迹化学发光试剂后，Luminol发生氧化降解，并发射波长为发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此的光，此光可经光可经X光胶片感光记录下来。光胶片感光记录下来。你现在浏览的是第二十四页，共123页Westernblotting应用应用SDS-PAGEpurifiedrecombinanthumanCK2(重组人酪蛋白激酶2)subunitanditsWesternblotting用已知的特异用已知的特异抗体检测目的抗体检测目的基因蛋白基因蛋白重组人酪蛋白激酶2 你现在浏览的是第二十五页，共123页三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较Westernblotting垂直槽垂直槽Northernblotting水平槽水平槽Southernblotting水平槽水平槽你现在浏览的是第二十六页，共123页n斑点印迹斑点印迹(dotblotting)n原位杂交原位杂交(insituhybridization)nDNA芯片技术芯片技术(DNAchip)其他印迹技术其他印迹技术你现在浏览的是第二十七页，共123页斑点印迹斑点印迹(dotblotting)nADotblotisatechniqueinmolecularbiologyusedtodetectbiomolecules.Itrepresentsasimplificationofthenorthernblot,southernblot,orwesternblotmethods.nInadotblotthebiomoleculestobedetectedarenotfirstseparatedbyelectrophoresis.Instead,amixturecontainingthemoleculetobedetectedisapplieddirectlyonamembraneasadot.nThisisthenfollowedbydetectionbyeithernucleotideprobes(foranorthernblotandsouthernblot)orantibodies(forawesternblot).你现在浏览的是第二十八页，共123页nThetechniqueofferssignificantsavingsintime,aschromatographyorgelelectrophoresis,andthecomplexblottingproceduresforthegelarenotrequired.nHowever,itoffersnoinformationonthesizeofthetargetbiomolecule.nFurthermore,iftwomoleculesofdifferentsizesaredetected,theywillstillappearasasingledot.nDotblotsthereforecanonlyconfirmthepresenceorabsenceofabiomoleculeorbiomoleculeswhichcanbedetectedbytheDNAprobesortheantibody.你现在浏览的是第二十九页，共123页你现在浏览的是第三十页，共123页原位杂交原位杂交(insituhybridization)nInsituhybridization(ISH)isatypeofhybridizationthatusesalabeledcomplementaryDNAorRNAstrand(i.e.,probe)tolocalizeaspecificDNAorRNAsequenceinasectionoftissue,or,ifthetissueissmallenough,intheentiretissue.nDNAISHcanbeusedtodeterminethestructureofchromosomes.nFluorescentDNAISH(FISH)can,forexample,beusedinmedicaldiagnosticstoassesschromosomalintegrity.nRNAISH(hybridizationhistochemistry)isusedtomeasureandlocalizemRNAsandothertranscriptswithintissuesectionsorwholemounts.你现在浏览的是第三十一页，共123页A：正常细胞，两绿两红.B：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，一绿一红两融合.D：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号，两红两绿一融合，这由于异常染色体上面的BCR和ABL基因分离造成的.E：一个t(9;22)(q34;q11.2)易位融合信号和一个额外的Ph 染色体。一红一绿三融合.你现在浏览的是第三十二页，共123页DNA芯片芯片将多种已知序列的将多种已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用排列在一定大小的固相支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类的技术。于检测细胞或组织样品中的核酸种类的技术。你现在浏览的是第三十三页，共123页第第二二节节PCR技术的原理与应用技术的原理与应用（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶链反应聚合酶链反应你现在浏览的是第三十五页，共123页PCR技术是技术是1985年由美国科学家年由美国科学家KaryBMullis建立的建立的体外体外扩增基因片段的方法，它具有扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等化等突出优点突出优点，是分子生物学技术中一项具有，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举革命性的创举。PCR方法被美国方法被美国Science杂志评为杂志评为1989年的十年的十大科技成就之一，而大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶聚合酶被评选为被评选为象征象征1989年的年的“年分子年分子”(themoleculeofyear)。你现在浏览的是第三十六页，共123页The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry MichaelSmithLaJolla,CA,USAKaryB.MullisUniversityofBritishColumbiaVancouver,Canadaforhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodforhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies你现在浏览的是第三十七页，共123页5 Primer15 Primer2Cycle2Cycle15 5 5 5 5 5 TemplateDNA一、一、PCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 你现在浏览的是第三十八页，共123页Cycle35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。你现在浏览的是第三十九页，共123页n模板模板DNAn特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶ndNTPsnMg2+PCR体系基本组成成分体系基本组成成分你现在浏览的是第四十页，共123页PCR反应反应循环循环变性变性95C左右左右延伸延伸适温适温退火退火Tm-5C经过经过30个左右的循环后，个左右的循环后，PCR的扩增倍的扩增倍数为数为(1+x)n,x=75%,n为循环数为循环数.你现在浏览的是第四十一页，共123页2.利用特异性引物以利用特异性引物以cDNA或基因组或基因组DNA为模板获为模板获得已知目的基因片段。得已知目的基因片段。3.利用简并引物从利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。具有一定同源性的基因片段。4.利用随机引物从利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中文库或基因组文库中随机克隆基因。随机克隆基因。1.与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。获得目的基因片段。二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆你现在浏览的是第四十二页，共123页（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途你现在浏览的是第四十三页，共123页三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术(RT-PCR)（二）原位（二）原位PCR技术技术(ISP)（三）实时（三）实时PCR技术技术(realtimePCR)你现在浏览的是第四十四页，共123页RT-PCR技术技术AAnATTnT55mRNA反转录酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA35355加热变性加入特异性引物DNA聚合酶PCR扩增出大量的产物你现在浏览的是第四十五页，共123页原位原位PCR技术技术(ISP)n原位PCR技术就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列（一般能扩增106倍），很容易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的优势，随着热循环自动化的提高与稳定也使得PCR技术的操作简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判断含特异性靶序列的细胞类型。你现在浏览的是第四十六页，共123页n原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。你现在浏览的是第四十七页，共123页multidrugresistanceassociated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociated-protein(mrp)genemultidrugresistanceassociatedprotein你现在浏览的是第四十八页，共123页实时实时PCR技术技术(realtimePCR)n常规常规PCR反应中产物以指数形式增加，在比较不同来源样反应中产物以指数形式增加，在比较不同来源样品的品的DNA或或cDNA含量时，产物的堆积将影响对检测样品中含量时，产物的堆积将影响对检测样品中原有模板含量差异的准确判断，因此只能作为半定量手段原有模板含量差异的准确判断，因此只能作为半定量手段应用。应用。n实时实时PCR(real-timePCR)技术通过动态监测反应过程中的产物技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。nRealtimePCR常用的两种方法分别为常用的两种方法分别为SYBRgreen（荧（荧光染料掺入法）和光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）（探针法）。你现在浏览的是第四十九页，共123页SYBRgreen（荧光染料掺入法）（荧光染料掺入法）n在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光荧光染料，染料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。你现在浏览的是第五十页，共123页你现在浏览的是第五十一页，共123页1、灵敏度高：使用、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增可使荧光效果增强到强到1000倍以上。倍以上。2、通用性好，不需要设计探针，方法简、通用性好，不需要设计探针，方法简便，省便，省时，价格低廉。时，价格低廉。3、通用型方法，在国内外科研中普遍使、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。用。4、高通量大规模的定量、高通量大规模的定量PCR检测。检测。5、专一性要求不高的定量、专一性要求不高的定量PCR检测。检测。此方法适用于：你现在浏览的是第五十二页，共123页Taqmanprobe（探针法）（探针法）PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团报告荧光基团和一个淬灭荧光基团淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。你现在浏览的是第五十三页，共123页探针法技术原理探针法技术原理你现在浏览的是第五十四页，共123页n1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性更高。好，特异性更高。n2、适用于扩增序列专一的体系的检测。、适用于扩增序列专一的体系的检测。n3、样品中靶基因含量过低的定量、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。检测。n4、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设、靶基因的特异序列较短，无论怎样优化引物设计条件都不能解决。计条件都不能解决。n5、存在与靶基因同源的序列，在、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。此方法适用于：你现在浏览的是第五十五页，共123页第第三三节节核核酸酸序序列列分分析析Nucleicacidsequenceanalysis你现在浏览的是第五十六页，共123页核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gilbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(Sanger法法)你现在浏览的是第五十七页，共123页一、化学裂解法一、化学裂解法(Maxam-Gilbert法法)基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNA链在链在1个或个或2个碱基处个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电片段，将这些片段经电泳分离。泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNA的的5末端，经放射自显影末端，经放射自显影即可在即可在X胶片上读出胶片上读出DNA链的序列。链的序列。你现在浏览的是第五十八页，共123页(Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT13OH5双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸脱去脱去二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法Sanger1958年和年和1980年两次获年两次获Nobel奖奖你现在浏览的是第五十九页，共123页你现在浏览的是第六十页，共123页你现在浏览的是第六十一页，共123页The Nobel Prize in Chemistry 1980forhisfundamentalstudiesofthebiochemistryofnucleicacids,withparticularregardtorecombinant-DNAfortheircontributionsconcerningthedeterminationofbasesequencesinnucleicacidsPaulBergWalterGilbertFrederickSanger1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeStanfordUniversityStanford,CA,USAHarvardUniversity,BiologicalLaboratoriesCambridge,MA,USAMRCLaboratoryofMolecularBiologyCambridge,UnitedKingdom你现在浏览的是第六十二页，共123页三、三、DNA自动测序自动测序用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动化的基础。动化的基础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记4种种ddNTP，然然后后进进行行Sanger测测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。通通过过4种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出4种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并依此确定并依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。你现在浏览的是第六十三页，共123页目前所用自动测序技术目前所用自动测序技术同位素标记到荧光标记同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记多色荧光标记毛细管电泳毛细管电泳单色荧光标记单色荧光标记平板电泳平板电泳同位素标记同位素标记平板电泳平板电泳A C G TACGT测序图谱测序图谱TATTGCATTGTCTGCATTGTCT你现在浏览的是第六十四页，共123页DNA测序仪示意图测序仪示意图computeranalysis凝胶中凝胶中DNA移动方向移动方向样品槽样品槽激光器激光器输入光学系统输入光学系统成象透镜成象透镜聚焦透镜聚焦透镜高灵敏度相机高灵敏度相机旋光镜旋光镜/棱镜组件棱镜组件你现在浏览的是第六十五页，共123页DNA自动测序结果举例自动测序结果举例你现在浏览的是第六十六页，共123页ABIPRISM310型型DNA测序仪测序仪你现在浏览的是第六十七页，共123页目前所用测序技术的缺点目前所用测序技术的缺点1、测序的原理是、测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为可能太长，目前为1000个核苷酸左右。个核苷酸左右。2、测序反应费时费力、测序反应费时费力科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗年的时间，耗费了费了30亿美元的费用。亿美元的费用。3、测序准确度不高、测序准确度不高DNA聚合酶造成的碱基错配，聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。序列判读错误。4、测序基于、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂的难反应，需要引物，并且有些结构复杂的难于进行于进行PCR反应的片段不能测序。反应的片段不能测序。你现在浏览的是第六十八页，共123页下一代测序技术下一代测序技术n下一代测序技术又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(RocheGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer)。你现在浏览的是第六十九页，共123页你现在浏览的是第七十页，共123页特点特点n测序策略主要基于循环芯片测序法（循环芯片测序法（Cyclic-arraysequencing），），即制备DNA文库，单分子扩增，在固相载体上形成DNA簇阵列，并行地利用DNA聚合酶或者连接酶进行酶促反应（模板变性、引物退火杂交、延伸或连接），同时读取反应产生的特异性荧光信号，最终得到超大量的DNA序列信息。n高通量并行测序。例如，RocheGSFLXsequencer一次就可对上百万条DNA分子同时进行序列测定，一次运行通量达到400Mb以上，而传统测序（一代测序）一轮测序的通量仅为80Kb左右。n单分子测序。传统测序（一代测序）是对多个DNA分子的混合物进行测序，其测序结果是多个DNA分子综合的序列信息；而二代测序先对单个DNA分子进行PCR以放大DNA分子数量（相当于单个DNA分子的克隆复制），再对这些DNA分子进行测序，就可以得到原来单个DNA分子的序列信息。你现在浏览的是第七十一页，共123页新型纳米孔测序法新型纳米孔测序法n新型纳米孔测序法（新型纳米孔测序法（nanoporesequencing）是采用电泳）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达长达1,000个碱基的单链个碱基的单链DNA分子、分子、RNA分子或者更短分子或者更短的核酸分子而言，的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现现24小时内只花费小时内只花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。组测序这一目标。你现在浏览的是第七十二页，共123页基基因因文文库库GeneLibrary第第四四节节你现在浏览的是第七十三页，共123页n基因组基因组DNA文库文库 (genomicDNAlibrary)ncDNA文库文库 (cDNAlibrary)基因文库基因文库 (genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。你现在浏览的是第七十四页，共123页一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息（包括所有的编码区和非编码区）以信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形片段形式贮存的克隆群体。式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、粘噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粒和酵母人工染色体等。你现在浏览的是第七十五页，共123页cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNA文库文库你现在浏览的是第七十六页，共123页你现在浏览的是第七十七页，共123页第第 五五 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biologicalchiptechnology你现在浏览的是第七十八页，共123页是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(genechip)你现在浏览的是第七十九页，共123页你现在浏览的是第八十页，共123页 将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定定量量分分析析的一种技术。的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)你现在浏览的是第八十一页，共123页Theworldshighest-densityproteinmicroarray,carrying22,000humanproteins你现在浏览的是第八十二页，共123页第六节第六节生物大分子相互作用生物大分子相互作用研究技术研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study你现在浏览的是第八十三页，共123页一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术n各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）n酵母双杂交酵母双杂交n荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析n噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术你现在浏览的是第八十四页，共123页标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析理的、分析蛋白质体外直接相互作用蛋白质体外直接相互作用的方法的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。子。你现在浏览的是第八十五页，共123页方法原理方法原理n该方法利用一种带有特定标签（tag）的纯化融合蛋白作为钓饵，在体外与