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二组织切片方法分类1切片法：石蜡切片、明胶切片、火棉胶切片、电镜超薄切片等（微米）2涂片法：血液等液体3磨片法：骨等坚硬组织4分离制片法：分离单个细胞平滑肌细胞、肝细胞等5印片法：肝、脾、淋巴结等6活体制片：注射胎盘兰等，观察巨噬细胞的活动7超活体染色制片：活体观察精子形态与活动等8整体切片法：用大型切片机，人胚、肝、肾、脑等第1页/共32页组织制片技术普通制片技术HE切片术一基本程序(一).动物取材必须根据科研或教学的目的与要求确定，医学领域以人的材料为最好，高级动物猴、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠等。动物麻醉法：1乙醚吸入麻醉：小鼠、大鼠、豚鼠等。在玻璃缸内进行。2注射麻醉法：苯巴比妥、乌拉坦等，猴、猫、狗、兔等大型动物，静脉或腹腔注射。3直接杀死法：小鼠、大鼠、豚鼠等，用金属器械猛击后脑部第四脑室区。第2页/共32页取材顺序：1腹腔器官：肝、胆、胃、肾上腺、胰、脾、十二指肠、空肠、回肠、结肠等2胸腔器官：心脏、肺3盆腔器官：膀胱、卵巢、输卵管、子宫等4神经系统：大脑、小脑、脊髓等5眼球、内耳第3页/共32页（二）固定目的：保持组织内细胞的形态、结构及其化学组成，使与生活时原有形态、结构及化学组成相似。1蛋白质、脂肪、类脂体、酶等沉淀或凝固抑制自溶。2组织内各种不同物质产生不同的折光率，便于显微镜下观察。3某些固定剂可起到硬化作用，有利于组织切片：甲醛、乙醇、氯仿等。4某些固定剂可起到媒染作用：重铬酸等。固定具体方法：1小块固定法110.3cm（不超过0.5cm厚）。2整体固定法（小动物灌流法），效果好。固定液能迅速渗透到各器官、组织。具有一定硬度，有利于薄切。可避免因取材时间过久保持新鲜状态。3蒸汽固定法用于涂片、印片等（骨髓涂片、淋巴印片）。第4页/共32页固定液：应具有以下性能1.对蛋白质、脂肪、类脂体、碳水化合物等具有沉淀、凝固作用。2.具有一定穿透力迅速进入组织。3.对组织不引起收缩或膨胀。4.对组织产生一定的硬化作用。5.具有一定pH值。6.对染色无副作用。第5页/共32页常用固定剂：1.单纯固定剂：甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸甲、锇酸等。甲醛：常用，pH值为中性。穿透组织速度快，固定均匀，组织收缩小。它是蛋白质最好的固定剂，在组织化学中广泛应用。乙醇：常用的固定剂与保存剂，穿透组织速度快。具有固定、凝固蛋白质作用，亦具有硬化组织和脱水等作用。丙酮：可作固定剂与脱水剂，对某些酶（碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等）固定效果好。锇酸：强氧化剂，不能与甲醛、乙醇等混合。使蛋白胶状固定而不发生沉淀，为脂肪、类质脂、髓鞘等优良固定剂。目前为电镜标本常用的固定剂。2.混合固定剂：甲醛混合固定剂、乙醇混合固定剂、丙酮混合固定剂、重铬酸甲混合固定剂、锇酸混合固定剂等。第6页/共32页（三）冲洗目的：1停止固定液继续对组织的作用。2除去组织中多余的固定剂，以免影响染色。方法：1.简易流水冲洗法。2系列玻璃瓶或水槽冲洗法。第7页/共32页(四）脱水目的：1.除去组织中含有的水分脱水。2.脱水后便于石蜡包埋等。脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等。方法：由低浓度逐渐升高浓度，以避免组织收缩。23mm5mm50%Alc68h612h70%68h612h（过夜）第8页/共32页80%46h68h95%（）24h36h95%（）24h36h100%（）12h24h100%（）12h24h第9页/共32页（五）组织透明乙醇不能与石蜡混合，需要经过一种乙醇与石蜡之间媒浸物，即透明剂。透明剂可能取代乙醇而使组织呈透明状，而液态石蜡则可取代透明剂乙醇进入组织。当液态石蜡形成固态之后，便于薄切。常用透明剂：二甲苯易挥发，折光率1。497，沸点144，透明力强。此外，甲苯、苯、氯仿、丁香油等。步骤：1先二甲苯：纯乙醇（1：1）2二甲苯第10页/共32页（六）包埋1渗蜡（浸蜡）：重要步骤。熔化为液态的石蜡透过组织间隙进入到组织中。步骤：（1）软蜡：熔点54560C透蜡（2）硬蜡：熔点56580C渗蜡以上均在温箱中进行。不能超过600C，否则变脆、收缩。2.包埋：硬蜡60620C第11页/共32页（七）切片切片机：回转切片机、滑动切片机、冷冻切片机等切片是整个制片过程中关键的步骤（切片厚度：46m）（八）切片贴展将薄切的切片贴附载玻片上要求：1牢固，染色时不能脱落。2展开皱褶，不影响将来的观察。第12页/共32页（九）染色染料：根据染料的来源分为天然染与人工染料两种。染色化学性质分为弱酸性、强酸性、弱碱性、强碱性及中性。依染色对象分为胞核染料与胞质染料。1染料的来源天然染料：为天然产物，从动物或植物体中提取的苏木精从苏木树的树心中提炼出来的为优质的细胞核染料。胭脂红（卡红）雌性介壳虫（胭脂虫）中加工而得染色质着色最佳。地衣红（俄西印）地衣纲质物（茶荠地衣）中提取弹性纤维染料。第13页/共32页人工合成染料：由芳香环或具有芳香环性质的杂环化合物所构成。硝基类（苦味酸）：胞浆染料醌型苯环类：甲基绿、甲基紫、酸性复红、水溶性苯胺兰、孔雀绿、亮绿等。丫叮染料：伊红丫、丫叮黄等。醌亚胺类染料：美兰、甲苯胺兰、硫堇、中性红等。偶氮类染料：偶氮卡红、桔黄G、苏丹、刚果红、胎盘兰等。（十）封片HE染色的步骤与方法染色步骤:1.切片脱蜡二甲苯510分钟2.切片从而甲苯中取出,无水乙醇中13分钟,洗去石蜡和二甲苯3.切片浸入95%乙醇中13分钟,组织切片呈白色4.切片浸入80%乙醇中12分钟,逐步降低乙醇浓度5.切片经lugol氏碘乙醇35分钟,除去组织中的汞盐沉淀6.普通水冲洗碘液7.金如5%硫代硫酸钠12分钟,洗去棕色8.普通水-蒸馏水漂洗,以备染色9.切片入苏木精染色,1015分钟10.水洗第14页/共32页 11.切片经盐酸切片经盐酸-酒精分色酒精分色1020秒秒.此为苏木精染色个关键此为苏木精染色个关键-细胞核染成深蓝色细胞核染成深蓝色12.充分水洗充分水洗(注意注意:不要洗掉切片不要洗掉切片!)13.0.51%伊红染胞质伊红染胞质310分钟分钟,淡红色即可淡红色即可14.95%乙醇中分色乙醇中分色13分钟分钟,洗去切片上多余的伊红洗去切片上多余的伊红15.95%乙醇中继续分色乙醇中继续分色13分钟分钟16.100%乙醇中脱水鉴别乙醇中脱水鉴别23分钟分钟17.100%乙醇中完全脱水乙醇中完全脱水23分钟分钟18.立即二甲苯中透明立即二甲苯中透明35分钟分钟19.中性树胶封片中性树胶封片20.镜检染色结果镜检染色结果:细胞核细胞核-深蓝色深蓝色,细胞质细胞质-红色红色,结缔组织为淡红色结缔组织为淡红色,肌纤维为红色肌纤维为红色,胶原纤维为红色胶原纤维为红色,软骨组织为深蓝色软骨组织为深蓝色,红细胞为桔红色红细胞为桔红色涂片涂片:血液等血液等铺片铺片:疏松结缔组织、肠系膜等疏松结缔组织、肠系膜等磨片：骨、牙等磨片：骨、牙等人工假象：凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、人工假象：凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、褶、色素沉着等。褶、色素沉着等。几种特殊显微镜：几种特殊显微镜：1相差显微镜相差显微镜观察组织活细胞，标本不染色，反差小。观察组织活细胞，标本不染色，反差小。2倒置显微镜倒置显微镜目镜在下，光源在上，观察瓶底培养的活细胞。目镜在下，光源在上，观察瓶底培养的活细胞。第15页/共32页人工假象第16页/共32页第17页/共32页第18页/共32页第19页/共32页第20页/共32页第21页/共32页第22页/共32页第23页/共32页第24页/共32页第25页/共32页第26页/共32页第27页/共32页第28页/共32页第29页/共32页小结:1。简述HE切片制备的大体程序？2。组织切片有几种方法？3。简述组织取材的大体顺序？第30页/共32页 谢谢 谢！谢！第31页/共32页感谢您的观看！第32页/共32页
