酶化学2学习教程.pptx

学习指导1、了解酶的化学本质和催化作用的特点，酶的组成和国际系统分类。2、掌握酶结构与功能之间的关系，掌握有关基本概念：必需基团、酶原激活的本质、活性中心、调节酶及静态酶的聚合和解聚；了解共价修饰的概念。3、掌酶促反应具有高效率和专一性的机理。4、掌握米氏方程、Km值的意义、求法及应用掌握有关理化因素对酶促反应速度的影响及有关的基本概念。5、理解酶活力单位的涵义，掌握酶活力的概念，了解测定酶活力的方法。第1页/共127页第一节概述一、酶的概念1、酶的概念酶是生物催化剂（1）所有的酶均由生物体产生，所有的生物体都产生酶（2）酶和生命活动密切相关几乎所有的生命活动或过程都有酶参加生物进化和组织分化的基础酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymatic reaction）。）。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（substratesubstrate）。）。）。）。第2页/共127页鸟嘌呤的分解代谢：鸟嘌呤脱氢酶鸟嘌呤黄嘌呤人、灵长类黄嘌呤氧化酶尿酸其他哺乳动物尿酸酶尿囊素硬骨鱼类尿囊素酶尿囊酸其他鱼类、两栖类尿囊酸酶尿素第3页/共127页 调节机构：酶的生成和反应活性是受到调节和控制的。A(A(E1E1)B()B(E2E2)C()C(E3E3)D()D(E4E4)F)FF-F-反馈调节反馈调节E1-E1-限速酶限速酶第4页/共127页2、酶的化学本质大多数酶是蛋白质依据：某些某些RNARNA有催化活性有催化活性19821982年美国年美国T.CechT.Cech等人发现四膜虫的等人发现四膜虫的rRNArRNA前体能前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNARNA有催化活性有催化活性 核酶（ribozyme）第5页/共127页二、酶的催化特性酶与一般催化剂比较酶与一般催化剂比较共性共性 （1 1）用量少而催化效率高：）用量少而催化效率高：（2 2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生变化；本身不发生变化；（3 3）降低反应所需的活化能）降低反应所需的活化能 第6页/共127页酶作为生物催化剂的特性 （1 1）高效率 以以摩摩尔尔为为单单位位进进行行比比较较，酶酶的的催催化化效效率率比比化化学学催催化化剂剂高高10107 710101313倍，比非催化反应高倍，比非催化反应高10108 810102020倍。倍。例例：2H2O22H2O+O2 反反反反 应应应应活化能活化能活化能活化能非催化反应非催化反应非催化反应非催化反应75.24kJ/mol75.24kJ/mol钯催化反应钯催化反应钯催化反应钯催化反应48.9kJ/mol48.9kJ/molH H2 2OO2 2酶催化酶催化酶催化酶催化8.36kJ/mol8.36kJ/mol第7页/共127页（2 2）专一性即酶只能对特定的一种或一类底物起作用，这种专一性是由酶蛋白的立体结构所决定的。第8页/共127页（3 3）反应条件温和酶促反应一般在pH 5-8pH 5-8 水溶液中进行，反应温度范围为20-4020-40 C C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。（4 4）酶的催化活性是受到调节和控制的如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。第9页/共127页三、酶的组成及分类1、酶的组成蛋白质部分：酶蛋白蛋白质部分：酶蛋白 (apoenzyme)辅因子辅因子(cofactor)金属离子金属离子小分子有机化合物小分子有机化合物全酶全酶(holoenzyme)结合酶结合酶结合酶结合酶 (conjugated enzyme)(conjugated enzyme)n n单纯酶单纯酶单纯酶单纯酶 (simple enzyme)n结合酶结合酶 全酶=酶蛋白+辅因子（辅酶、辅基）第10页/共127页q*各部分在催化反应中的作用各部分在催化反应中的作用q酶蛋白酶蛋白决定酶作用的专一性决定酶作用的专一性q辅因子辅因子参与化学反应，决定酶促反应的类型参与化学反应，决定酶促反应的类型第11页/共127页辅因子分类辅因子分类（按其（按其与酶蛋白结合的紧密程度与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合与酶蛋白结合疏松，可用疏松，可用透析或超滤的透析或超滤的方法除去。方法除去。辅基辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合与酶蛋白结合紧密，不能用紧密，不能用透析或超透析或超滤的方法除去滤的方法除去。第12页/共127页酶的不同形式单体酶(monomeric enzyme)(monomeric enzyme)：仅由单一肽链组成的具有完全催化活性的酶。寡聚酶(oligomeric enzyme)(oligomeric enzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系(multienzyme system)(multienzyme system)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。A(A(E1E1)B()B(E2E2)C()C(E3E3)D()D(E4E4)F)F第13页/共127页2、酶的命名与分的命名与分类(一一)习惯命名法命名法(二二)国国际系系统命名法命名法19611961年国际酶学委员会年国际酶学委员会（enzyme commissionenzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。）提出的酶的命名和分类方法。系系统名名应包括；包括；底物（构型）底物（构型）（酶作用的基作用的基团）、催化反、催化反应的的类型型不管酶催化正反应还是逆反应，都用同一名称。不管酶催化正反应还是逆反应，都用同一名称。习惯名称名称系系统名称名称谷丙谷丙转氨氨酶丙氨酸丙氨酸 ：酮戊二酸戊二酸氨基氨基转移移酶乙醇脱乙醇脱氢酶 乙醇：乙醇：NAD+氧化氧化还原原酶第14页/共127页 （1 1）分类:6 6大类酶，氧化还原、转移、水解、裂合、异构、合成（2 2）编号:用4 4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以ECEC（为Enzyme Enzyme CommissionCommission）。EC EC 类.亚类.亚亚类.排号，如第15页/共127页第一个数字：6大类，指明反应性质第二个数字：底物中被作用的基团或键的特点（亚类）第三个数字：参加反应的底物的性质，或酶促反应作用的某一具体化学键，更精确地表示底物的性质（亚亚类）第四个数字：该种酶的序号第16页/共127页第17页/共127页第18页/共127页(1)(1)氧化氧化-还原酶还原酶 OxidoreductaseOxidoreductase AH AH2 2 +B =A +BH +B =A +BH2 2乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶第19页/共127页AB +C =A +CB谷丙转氨酶(2)(2)转移酶 TransferaseTransferase第20页/共127页主要包括主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。等。A AB+B+HOHHOHA AOHOH +B +BH H如：脂酶如：脂酶(Lipase)(Lipase)(3)(3)水解酶水解酶 hydrolasehydrolase第21页/共127页催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。键的反应及其逆反应。醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。AB =A +BAB =A +B如：延胡索酸水合酶如：延胡索酸水合酶(4)(4)裂合酶裂合酶 LyaseLyase第22页/共127页催化各种同分异构体的相互转化 A=B如：葡萄糖异构酶(5)(5)异构酶异构酶 IsomeraseIsomerase第23页/共127页(连接酶)能够催化与ATPATP分解反应相偶联的由小分子合成大分子的反应。A+B+ATP+H-O-H A+B+ATP+H-O-H A A B+ADP+Pi B+ADP+Pi 丙酮酸羧化酶 ATP+ATP+丙酮酸 +COCO2 2 草酰乙酸+ADP+Pi+ADP+Pi(6)(6)合成酶 Ligase or SynthetaseLigase or Synthetase第24页/共127页酶的编号（乳酸脱氢酶为例）酶的编号（乳酸脱氢酶为例）EC 1.1.1.27第一大类，氧化还第一大类，氧化还原酶原酶 第一亚类，被氧化基第一亚类，被氧化基团为团为 CHOH 第一亚亚类，氢第一亚亚类，氢受体为受体为 NAD+第25页/共127页第二节酶的结构与功能的关系一、酶的一级结构与催化功能的关系1、必需基团：与酶的催化活性直接相关概念：必需基团必需基团必需基团必需基团结合基团结合基团(binding group)与底物相结合与底物相结合与底物相结合与底物相结合催化基团催化基团(catalytic group)促进底物发生化学变化促进底物发生化学变化 第26页/共127页2、酶原激活酶原酶原酶原酶原 (zymogen)(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是有些酶在细胞内合成或初分泌时只是有些酶在细胞内合成或初分泌时只是有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活酶原的激活酶原的激活酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化在一定条件下，酶原向有活性酶转化在一定条件下，酶原向有活性酶转化在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。的过程。的过程。的过程。第27页/共127页赖赖缬缬天天天天天天天天甘甘异异赖赖缬缬天天天天天天天天缬缬组组丝丝S SS SS SS S464618183 3甘甘异异缬缬组组丝丝S SS SS SS S肠激酶肠激酶肠激酶肠激酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶活性中心活性中心活性中心活性中心胰蛋白酶原的激活过程胰蛋白酶原的激活过程胰蛋白酶原的激活过程胰蛋白酶原的激活过程第28页/共127页 酶原激活的机理酶原激活的机理酶酶 原原分子构象发生改变分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽掉一个或几个短肽在特定条件下在特定条件下第29页/共127页 酶原激活的生理意义酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。酶原激活的本质第30页/共127页酶原激活原激活胰蛋白胰蛋白酶原原肠激激酶 六六肽胰蛋白胰蛋白酶弹性蛋白性蛋白酶原原胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶原原胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶弹性蛋白性蛋白酶羧肽酶原原羧肽酶第31页/共127页3、共价修饰寻找必需基团的有效方法共价修饰共价修饰(covalent modification)在在其其他他酶酶的的催催化化作作用用下下，某某些些酶酶蛋蛋白白肽肽链链上上的的一一些些基基团团可可与与某某种种化化学学基基团团发发生生可可逆逆的的共共价价结结合合，从从而而改改变变酶的活性，此过程称为共价修饰。酶的活性，此过程称为共价修饰。酶分子中可以被共价修饰的基团：酶分子中可以被共价修饰的基团：酶分子中可以被共价修饰的基团：酶分子中可以被共价修饰的基团：巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基第32页/共127页二、酶的活性与其高级结构的关系（1）活性中心的概念：或称活性部位）活性中心的概念：或称活性部位(active site)酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，这个部位就是酶的活性中心。作用直接有关，这个部位就是酶的活性中心。1、活性中心(active center)第33页/共127页组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有GluGlu和ASPASP的-COOH-COOH，LysLys的-NH-NH2 2，HisHis的咪唑基，SerSer的-OH-OH，CysCys的-SH-SH，TyrTyr的侧链基团。酶活性中心 结合部位：与底物结合的部分 （特异性决定部位）催化部位：促进底物发生化学变化的部分第34页/共127页活性中心内的必需基团活性中心内的必需基团结合基团结合基团(binding group)与底物相结合与底物相结合与底物相结合与底物相结合催化基团催化基团(catalytic group)催化底物转变成产物催化底物转变成产物 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。的空间构象所必需。活性中心外的必需基团活性中心外的必需基团第35页/共127页底 物 活性中心以外的必需基团结合基团催化基团 活性中心 第36页/共127页（2）活性中心是由高级结构形成单纯酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团。结合酶：活性中心主要是辅因子，以及与其紧密偶联的蛋白质的结构区域。对于寡聚酶则可能有聚合在一起的几个亚基上的几个相距远的氨基酸残基组成。（3）其他部位的作用为使催化基团和结合基团聚集起来，为酶活性中心的形成提供结构基础。酶的高级结构对保证其活力来说，比一级结构更重要。第37页/共127页2、二、三级结构与酶活性的关系牛胰核糖核酸酶折合实验3、聚合与解聚四级结构与酶活性的关系静态酶调节酶：限速酶、关键酶，静态酶：调节酶：聚合：活性态解聚：是否具有活性由解聚条件决定聚合：活性态解聚：非活性 大多数 （少数情况相反）第38页/共127页4、同工酶（1）同工酶的概念：（2）同工酶的结构和功能非活性中心部分不同，或所含亚基组合情况不同，与活性有关的结构部分均相同。同工酶存在于同一种属，同一个体的同一组织或不同组织中。同工酶存在于同一种属，同一个体的同一组织或不同组织中。同工酶存在于同一种属，同一个体的同一组织或不同组织中。同工酶存在于同一种属，同一个体的同一组织或不同组织中。结构、组成不同。结构、组成不同。结构、组成不同。结构、组成不同。同工酶理化性质（分子量、溶解度、电泳形式）、免疫学同工酶理化性质（分子量、溶解度、电泳形式）、免疫学同工酶理化性质（分子量、溶解度、电泳形式）、免疫学同工酶理化性质（分子量、溶解度、电泳形式）、免疫学性质不同性质不同性质不同性质不同 同工酶多数为寡聚酶。同工酶多数为寡聚酶。同工酶多数为寡聚酶。同工酶多数为寡聚酶。第39页/共127页*举例：举例：举例：举例：乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH(LDH1 1 LDHLDH5 5)第40页/共127页H HH HH HH HH HH HH H MMH HH HMMMMH HMMMMMMMMMMMMMMLDHLDH1 1 (H(H4 4)LDHLDH2 2(H(H3 3M)M)LDH LDH3 3(H(H2 2MM2 2)LDHLDH4 4(HM(HM3 3)LDHLDH5 5 (M(M4 4)乳酸脱氢酶的同工酶乳酸脱氢酶的同工酶第41页/共127页乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌:乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌:LDH1第42页/共127页血清LDH同工酶酶谱的变化规律心脏疾病 LDH1LDH1及LDH2LDH2上升，LDH3LDH3及 LDH4LDH4下降。急性肝炎 LDH5LDH5明显升高，随病情好转 而逐渐恢复正常。慢性肝炎 一般处于正常范围，部分病例可见LDH5LDH5有所升高。肝硬变 LDH5,LDH1LDH5,LDH1和LDH3LDH3均升高。节首原发性肝癌原发性肝癌 LDHLDHLDHLDH3 3 3 3,LDH,LDH,LDH,LDH4 4 4 4,LDH,LDH,LDH,LDH5 5 5 5均上升，但均上升，但LDHLDHLDHLDH5 5 5 5LDHLDHLDHLDH4 4 4 4转移性肝癌转移性肝癌 LDHLDHLDHLDH3 3 3 3,LDH,LDH,LDH,LDH4 4 4 4,LDH,LDH,LDH,LDH5 5 5 5均上升，但均上升，但LDHLDHLDHLDH4 4 4 4LDHLDHLDHLDH5 5 5 5第43页/共127页第三节酶催化反应的机制一、酶促反应的本质1、酶是催化剂酶与一般催化剂的共同点2 2、加速反应的本质、加速反应的本质降低活化能降低活化能化学反应过程化学反应过程 A+B AB C +D 反应物（初态）反应物（初态）中间产物（过渡态中间产物（过渡态）产物（终态）产物（终态）从反应物（初态）转化成中间产物（过渡态）需要从反应物（初态）转化成中间产物（过渡态）需要的能量即活化能，活化能越大，反应越难进行。的能量即活化能，活化能越大，反应越难进行。n加速化学反应的方法：-向反应体系提供能量 -降低活化能第44页/共127页酶促反应活化能的改变反应总能量改变反应总能量改变酶促反应活化能酶促反应活化能非催化反应活化能非催化反应活化能 一般催化剂催一般催化剂催化反应的活化能化反应的活化能能能量量反反 应应 过过 程程底物底物产物产物第45页/共127页q酶促反应具有极高的效率酶酶的的催催化化效效率率通通常常比比非非催催化化反反应应高高1081020倍倍，比一般催化剂高比一般催化剂高1071013倍。倍。酶的催化不需要较高的反应温度。酶的催化不需要较高的反应温度。酶酶和和一一般般催催化化剂剂加加速速反反应应的的机机理理都都是是降降低低反反应应的的活活化化能能(activation energy)。酶酶比比一一般般催催化化剂剂更更有有效地降低反应的活化能。效地降低反应的活化能。第46页/共127页3 3、中间产物学说在酶促反应中 酶与底物形成不稳定的中间复合物E-SE-S。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E +S =E-S E +S =E-S P +E P +E第47页/共127页关于酶作用专一性的几种假说关于酶作用专一性的几种假说 锁钥学说：锁钥学说：（lock and Key theory）二、酶促反应机制二、酶促反应机制1 1、酶作用专一性的机制、酶作用专一性的机制诱导契合学说诱导契合学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样匙对一把锁一样第48页/共127页第49页/共127页2、诱导契合学说（、诱导契合学说（induced-fit theory）酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，但酶的活性中心具有一定的柔性，两者相遇底物诱导酶构象发生变化，才形成了互补形状。第50页/共127页诱导契合学说：诱导契合学说：酶的活性中心具有一定的适应性，当专一性底酶的活性中心具有一定的适应性，当专一性底物与活性中心结合时，酶蛋白会发生一定的构象变化，使反应物与活性中心结合时，酶蛋白会发生一定的构象变化，使反应所需要的酶的催化基团与结合基团正确地排列并定位，与底物所需要的酶的催化基团与结合基团正确地排列并定位，与底物契合。两者相遇底物诱导酶构象发生变化，才形成了互补形状。契合。两者相遇底物诱导酶构象发生变化，才形成了互补形状。第51页/共127页第52页/共127页第53页/共127页2、酶作用高效性的机制1 1 1 1）共价催化）共价催化）共价催化）共价催化2 2 2 2）酸碱催化）酸碱催化）酸碱催化）酸碱催化第54页/共127页1)1)共价催化共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化应速度的过程，称为共价催化。原理：亲核基团：亲核基团：HisHis的的咪唑基咪唑基，CysCys的的-SH-SH，SerSer的的-OH-OH等。等。共价催化共价催化 亲电催化亲电催化 亲核催化亲核催化第55页/共127页2)2)酸碱催化(广义)概念：狭义酸碱催化剂和广义酸碱催化剂：第56页/共127页酶分子中可以作为广义酸、碱的基团酶分子中可以作为广义酸、碱的基团第57页/共127页影响酸碱催化的因素酸碱的强度功能基提供质子和接受质子的速度His的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最有效、最活泼的一个催化功能团，是许多酶的活性中心的构成成分。咪唑基：解离常数为6.0；半衰期小于10-10s.第58页/共127页第四节酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及各种因素对反应速度的影响，其中酶与底物之间的作用问题是研究酶促反应的核心问题。第59页/共127页一、酶促反应的基本动力学1、底物浓度的影响在低底物浓度时在低底物浓度时,反应速度反应速度与底物浓度成正比，表现为与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。一级反应特征。混合级反应混合级反应当底物浓度达到一定值，反当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（应速度达到最大值（VmaxVmaxVmaxVmax），），此时再增加底物浓度，反应此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级速度不再增加，表现为零级反应。反应。第60页/共127页当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。SSV VVmaxVmax第61页/共127页随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。SSV VVmaxVmax第62页/共127页当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应SSV VVmaxVmax第63页/共127页2、米氏方程MichaelisMichaelis和和和和MentenMenten提提提提出出出出反反反反应应应应速速速速度度度度与与与与底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度关关关关系系系系的的的的数数数数学学学学方方方方程程程程式式式式，即即即即米米米米曼曼曼曼氏氏氏氏方方方方程程程程式式式式，简简简简称米氏方程式称米氏方程式称米氏方程式称米氏方程式(Michaelis equation)(Michaelis equation)。VmaxS Km+S S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)第64页/共127页E+S k1k2k3ESE+P以反应产物P的生成速度代表这个酶促反应速度v，则：V=K3ES (2)ES的生成速度K1ESES的分解速度K2ES+K3 ES=(K2+K3)ES 当反应体系中ES达到动态平衡时，ES的生成速度 ES的分解速度，即：K1ES=(K2+K3)ES(1)第65页/共127页所以：令：带入上式，得：(3)设酶的总浓度为E0，则游离酶的浓度为：E=E0-ES，带入（3）式，得：第66页/共127页所以：（4）将（4）带入（2），得：（5)第67页/共127页当底物浓度S远远大于E0时，所有酶都被底物所饱和，此时，反应速度达到最大值，Vmax=K3E0(6)将（6）带入（5），得米氏方程：V VmaxmaxS S KKmm+S+SV=V=第68页/共127页3、Vmax和Km当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时v K Kmm值的推导值的推导KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/L。2Km+S Vmax VmaxSV VmaxmaxV VSSKKmmV Vmaxmax/2 /2 第69页/共127页 VmaxVmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：意义：Vmax=K3 E第70页/共127页（1）Km值的求法 1 1 1 1 K K K Km 1 1m 1 1m 1 1m 1 1 =+V V V V V V V Vmax S max S max S max S V V V Vmaxmaxmaxmax双倒数作图法 V VmaxmaxS S KKmm+S+SV=V=第71页/共127页斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax 1 1 1 1 K K K Km 1 1m 1 1m 1 1m 1 1 =+V V V V V V V Vmax S max S max S max S V V V Vmaxmaxmaxmax第72页/共127页（2）米氏常数是酶学研究中的重要数据不同的酶具有不同不同的酶具有不同不同的酶具有不同不同的酶具有不同K K K Km m m m值，它是酶值，它是酶值，它是酶值，它是酶特征物理常数特征物理常数特征物理常数特征物理常数，固固固固定温度定温度定温度定温度、pHpHpHpH、缓冲体系等条件缓冲体系等条件缓冲体系等条件缓冲体系等条件。K K K Km m m m值的应用是有条件的值的应用是有条件的值的应用是有条件的值的应用是有条件的测定测定Km可以作为鉴别酶的一种手段，可以作为鉴别酶的一种手段，但必须是在指定的实验条但必须是在指定的实验条件下。件下。K K K Km m m m值可以反映酶与底物的亲和力值可以反映酶与底物的亲和力值可以反映酶与底物的亲和力值可以反映酶与底物的亲和力同一种酶的不同的底物有不同同一种酶的不同的底物有不同K K K Km m m m值，其中值，其中K K K Km m m m值最小的值最小的底物为最适底物。底物为最适底物。1/K1/K1/K1/Km m m m值近似表示酶与底物之间的亲和力值近似表示酶与底物之间的亲和力第73页/共127页（3 3）酶的K Km m值在实际应用中的意义鉴定酶。判断酶的最适底物计算一定速度下的底物浓度例1要求酶按其最大反应速度的99的速度进行反应，求所需底物浓度。例2已知Cs=9Km，求该酶体系的反应速度。了解酶的底物在体内具有的浓度水平判断反应方向或趋势判断抑制类型第74页/共127页二、酶浓度对酶反应速率的影响当当当当SSEE，酶酶酶酶可可可可被被被被底底底底物物物物饱饱饱饱和和和和的的的的情情情情况况况况下下下下，反反反反应速度与酶浓度成正比。应速度与酶浓度成正比。应速度与酶浓度成正比。应速度与酶浓度成正比。关系式为：关系式为：关系式为：关系式为：V=KV=K3 3 E E0 V E 当SE时，Vmax=k3 E 酶浓度对反应速度的影响 第75页/共127页三、温度对酶促反应速度的影响1、最适温度第76页/共127页2、温度对酶促反应速度影响的两个方面1 1）温度升高）温度升高,酶促反应速度加快。酶促反应速度加快。2 2）温度升高）温度升高,酶变性，导致酶活性降低甚至丧失。酶变性，导致酶活性降低甚至丧失。温血动物体内酶最适温度：温血动物体内酶最适温度：温血动物体内酶最适温度：温血动物体内酶最适温度：3535353540 40 40 40 植物体内酶最适温度：植物体内酶最适温度：植物体内酶最适温度：植物体内酶最适温度：4040404050 50 50 50 微生物体内酶最适温度：微生物体内酶最适温度：微生物体内酶最适温度：微生物体内酶最适温度：4040404050 50 50 50 或很高或很高或很高或很高大部分酶大部分酶大部分酶大部分酶60 60 60 60 以上变性，少数例外。以上变性，少数例外。以上变性，少数例外。以上变性，少数例外。3、最适温度不是酶的特征性物理常数第77页/共127页四、pH值对酶促反应速度的影响1、最适pH值一般酶的最适一般酶的最适pHpH为为6-86-8。第78页/共127页0酶酶活活性性pH pH对某些酶活性的影响 胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶 胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱酯酶胆碱酯酶 246810第79页/共127页2 2、pHpH影响酶促反应速度的原因 影响酶和底物的解离影响酶分子的构象最适最适pH不是酶的特征常数不是酶的特征常数。第80页/共127页五、激活剂对酶促反应速率的影响1、激活剂的概念：凡能提高酶的活性，加速酶促反应进行的物质都称为激活剂或活化剂(activator)。注意与酶原激活的区别：注意与酶原激活的区别：2、激活剂种类、激活剂种类（1）无机离子：）无机离子：金属阳离子，如Mg2+；阴离子如Cl-；H（2）简单有机物某些还原剂，如巯基乙醇；EDTA，解除抑制剂的抑制作用（3）蛋白质3、激活剂对酶的作用具有一定的选择性第81页/共127页六、抑制剂对酶促反应速率的影响1、抑制作用的概念失活作用：使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性抑制作用：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的作用。蛋白变性的作用。酶的抑制剂酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。去激活作用：金属螯合作用第82页/共127页2、抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversible inhibition)可逆性抑制(reversible inhibition)：竞争性抑制竞争性抑制 (competitive inhibition)非竞争性抑制非竞争性抑制 (non-competitive inhibition)反竞争性抑制反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition)第83页/共127页（1）不可逆抑制（irreversibleinhibition)概念：抑制剂与酶活性中心必需基团以共价键结合，引起酶活性丧失。不能用透析或超滤等方法去除抑制剂。不能用透析或超滤等方法去除抑制剂。结合部位：活性中心必需基团结合方式：共价键分类：根据抑制剂对酶选择性的方式非专一性不可逆抑制专一性不可逆抑制第84页/共127页可逆抑制（reversible inhibition)v概念：抑制剂与酶蛋白以非共价键结合，具有可逆性，可用透析、过滤等方法将抑制剂除去。v结合部位：活性中心，非活性中心v结合方式：非共价键第85页/共127页竞争性抑制作用定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。*特点特点b)b)抑抑制制程程度度取取决决于于抑抑制制剂剂与与酶酶的的相相对对亲亲和和力力及底物浓度；及底物浓度；a)I与与S结构类似，竞争酶的活性中心；结构类似，竞争酶的活性中心；第86页/共127页*举例举例 丙二酸丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶琥珀酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸延胡索酸第87页/共127页+I IE EI IE+SE+SE+PE+PESES反应模式反应模式第88页/共127页第89页/共127页非竟争性抑制E可同时与S及I结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降,称为非竞争性抑制剂。*反应模式反应模式反应模式反应模式E+SE+SESESE+PE+P+I IE EI I+S +S E EI IS S +I I*特点特点a)a)抑抑制制剂剂与与酶酶活活性性中中心心外外的的必必需需基基团团结结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；合，底物与抑制剂之间无竞争关系；b)b)抑制程度取决于抑制剂的浓度；抑制程度取决于抑制剂的浓度；第90页/共127页第91页/共127页反竟争性抑制反竟争性抑制反竟争性抑制反竟争性抑制抑制剂只能与酶抑制剂只能与酶抑制剂只能与酶抑制剂只能与酶-底物复合物（底物复合物（底物复合物（底物复合物（ESESESES）结合形成）结合形成）结合形成）结合形成ESIESIESIESI，但该复合物不能转变成产物。但该复合物不能转变成产物。但该复合物不能转变成产物。但该复合物不能转变成产物。*反应模式E+SE+SE+P E+P ESES+I IESESI I第92页/共127页第93页/共127页第五节酶的制备一、酶的制备及纯化1选材2破碎细胞3抽提4去核酸、去多糖5纯化6保存由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1全部操作在低温04。2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量-巯基乙醇。4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。第94页/共127页二、酶的活力测定1、定性测定根据酶催化的化学反应判断2、活力单位表示酶量的指标（1）酶活力的概念酶活力（酶活力（activity):activity):酶催化一定化学反应酶催化一定化学反应 的能力。的能力。其衡量的标准是酶促反应速度。其衡量的标准是酶促反应速度。酶促反应速度酶促反应速度可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物可在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。的消耗或产物的生成量来表示。的消耗或产物的生成量来表示。的消耗或产物的生成量来表示。酶活力测定中需要注意的问题酶活力测定中需要注意的问题最适条件最适条件反应初期测定，保持反应速度恒定反应初期测定，保持反应速度恒定第95页/共127页Pt测定酶活力时注意应测反应初速度（initial velocity）：底物被消耗5%以内的速度反应速度。斜率=v第96页/共127页（2）酶活力单位酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度，它反映在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。习惯规定：国际单位(IU)在标准条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。（标准条件？）催量单位(katal)催量(kat)是指在最适条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量。kat与IU的换算：1IU=16.6710-9kat第97页/共127页3、比活力酶的比活力酶的比活力:酶的比活力酶的比活力=活力单位数活力单位数/毫克酶蛋白（氮）毫克酶蛋白（氮）比活力说明酶的纯度。第98页/共127页4、转换数概念：概念：相相当当于于一一旦旦产产物物酶酶（ESES）中中间间物物形形成成后后，酶酶将将底物转化成产物的效率。底物转化成产物的效率。5 5、酶活力的定量测定方法、酶活力的定量测定方法例：福林酚法测蛋白酶活力。例：福林酚法测蛋白酶活力。该该方方法法的的基基本本原原理理是是以以酪酪蛋蛋白白为为底底物物进进行行反反应应，然然后后用用福福林林酚酚试试剂剂显显色色，并并用用分分光光光光度度计计测测定定酶酶促反应产物酪氨酸的生成量。（促反应产物酪氨酸的生成量。（A A650650660660）第99页/共127页实验操作：（1）将0.5g酶用缓冲液稀释至1000ml。（2）取1ml酶液加入1ml2酪蛋白，40，10min。（3）加入2ml三氯醋酸，生成沉淀，过滤，得到滤液。（4）1ml滤液加入1ml福林酚试剂，测定A A660660样品。（5 5）同时作一空白样。酶活力单位定义：在给定条件下，以每分钟产生1 1g g酪氨酸的酶量为一个单位。求1g1g蛋白酶的酶活力。第100页/共127页习题1、