重组人胰岛素生产工艺.pptx

结构：胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。第1页/共18页3D Structure of Insulin胰岛素二聚体（胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer）第2页/共18页胰岛素的性质 第3页/共18页胰岛素的功能 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。第4页/共18页胰岛素的研究历史 1921年-从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年-重结晶胰岛素1930s-传统中、长效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末-半合成胰岛素1982年-采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今-重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。第5页/共18页胰岛素制备工艺胰岛素制备工艺 以动物胰脏为原料提取胰岛素以动物胰脏为原料提取胰岛素-酸醇提取法酸醇提取法 传统胰岛素传统胰岛素-猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶 单峰胰岛素单峰胰岛素-凝胶过滤纯化凝胶过滤纯化 单组分胰岛素单组分胰岛素-凝胶过滤、离子交换纯化凝胶过滤、离子交换纯化 半合成胰岛素半合成胰岛素-以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组重组DNADNA技术生产人胰岛素技术生产人胰岛素 AB链合成：分别表达链合成：分别表达AB链，化学方法连接链，化学方法连接 逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素第6页/共18页重组DNA技术制造人胰岛素 1.AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。已被淘汰第7页/共18页Ins A链链Ins B链转化大肠杆菌转化大肠杆菌发酵发酵A链B链纯化二硫键活性胰岛素活性胰岛素AB链合成人胰岛素AB链合成法链合成法第8页/共18页2.反转录酶法：仿照天然合成途径 通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。第9页/共18页提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法：（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作 第10页/共18页提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。主要有如下2种方法：（1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。（2）煮沸法 第11页/共18页基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。第12页/共18页将质粒送回大肠杆菌：在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。第13页/共18页胰岛素的产生：再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。（注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。）第14页/共18页质粒Ins mRNA反转录Ins cDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切 提取质粒限制性内切酶酶切 反转录酶法合成人胰岛素第15页/共18页重组胰岛素的质量控制测定生物活性效价测定控制产品中杂质或潜在有害物质保证产品安全性和有效性长期重复大剂量使用第16页/共18页谢谢！第17页/共18页感谢您的观看！第18页/共18页