Western Blot 的原理流程及常见问题分析教案.pptx

会计学1Western Blot 的原理流程及常见问题分的原理流程及常见问题分析析主要内容主要内容一、一、一、一、Western Blot Western Blot 技术原理与实验流程技术原理与实验流程技术原理与实验流程技术原理与实验流程二、二、二、二、Western Blot Western Blot 技术常见问题分析技术常见问题分析技术常见问题分析技术常见问题分析2第1页/共23页3 Western Blot定义定义 Western BlotWestern Blot又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。Western Blot 应用目的：检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中某种蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究第2页/共23页 Western Blot实验流程实验流程4Step4 转膜转膜Step6 免疫反应免疫反应 Step7 检测检测Step2 蛋白定量蛋白定量Step3 SDS-PAGEStep1 蛋白提取蛋白提取 Step5 封闭封闭第3页/共23页确定蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂 防止蛋白质的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制剂 Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽提试剂 Tis-组织蛋白抽提试剂 Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂步骤一、蛋白提取5第4页/共23页6步骤二、蛋白定量步骤二、蛋白定量 Bradford检测范围：100-1,500 ug/mlBCA检测范围：20-2,000 ug/mlLowry检测范围：11500ug/ml第5页/共23页7BCA定量定量 n 在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。n 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。梯梯度度稀稀释释第6页/共23页 步骤三、SDS-PAGE 电泳8l上样前煮沸样品l上样量：30-100 gl蛋白Marker第7页/共23页9步骤四、转膜步骤四、转膜3 膜的选择：NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法：半干转、湿转 转膜确认：立春红染色、蛋白预染Marker第8页/共23页膜的选择10第9页/共23页11转移方法转移方法pp半干转半干转半干转半干转 用滤纸吸用滤纸吸B Bufferuffer来做转移体系来做转移体系 适合转移小分子量的蛋白；适合转移小分子量的蛋白；半干转的电流大小是按照面积来算的，半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据时间是根据 蛋白分子大小定的；蛋白分子大小定的；56mA/56mA/膜膜 1h 1h pp湿转湿转湿转湿转 将膜、胶、滤纸全浸泡在将膜、胶、滤纸全浸泡在B Bufferuffer的的TankTank里里 适合转移大分子量（适合转移大分子量（100KD100KD以上）蛋白；以上）蛋白；湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；300mA 300mA 1h1h第10页/共23页转移操作转移操作12+阳极阳极-阴极阴极多孔垫片多孔垫片滤纸滤纸凝胶凝胶膜滤纸滤纸 垫片垫片 2 2层滤纸层滤纸 膜（左上角标记）膜（左上角标记）凝胶（凝胶（Marker靠左）靠左）2 2层滤纸层滤纸 垫片垫片黑色夹板（负极）黑色夹板（负极）56mA/膜 1h300mA 1h白色夹板（正极）白色夹板（正极）第11页/共23页13 转膜后确认转膜后确认uu丽春红丽春红丽春红丽春红 可逆染色，检测转膜效率。可逆染色，检测转膜效率。与下游与下游WBWB检测完全兼容，无任何干检测完全兼容，无任何干扰。扰。uu蛋白预染蛋白预染蛋白预染蛋白预染MarkerMarker 实时监测实时监测 分子量参照分子量参照 与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。测转膜效率。uu对转膜后的凝胶进行考染对转膜后的凝胶进行考染对转膜后的凝胶进行考染对转膜后的凝胶进行考染丽春红染色结果丽春红染色结果第12页/共23页14步骤五、封步骤五、封 闭闭去除非特异结合位点：去除非特异结合位点：去除非特异结合位点：去除非特异结合位点：Blocking Buffer Blocking Buffer：3 3%BSA%BSA 5%Milk 5%Milk Room Temperature 1 h Room Temperature 1 h 第13页/共23页一抗的选择：确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.步骤六、抗体孵育15第14页/共23页16步骤六、抗体孵育步骤六、抗体孵育 二抗的选择：抗小鼠抗小鼠抗兔抗兔抗大鼠抗大鼠抗人抗人抗山羊抗山羊抗鸡抗鸡抗豚鼠抗豚鼠抗马抗马标记物标记物HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记、荧光标记、无标记荧光标记抗体荧光标记抗体红色Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、Dylight 649绿色FITC、Cy2、Dylight488蓝色AMCA近红外线Cy5 根据一抗物种：根据标记物：第15页/共23页步骤七、检测方法步骤七、检测方法17化学发光法：化学发光法：化学发光法：化学发光法：HRPHRP酶标系统酶标系统-ECLECL鲁米诺（鲁米诺（LuminolLuminol）特点特点特点特点：无毒害、灵敏度高、速度快；：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽；特异性好、节省抗体、线性宽；可重新剥离检测。可重新剥离检测。化学显色法：化学显色法：化学显色法：化学显色法：酶标系统酶标系统HRPHRP-TMBTMB和和DABDAB 酶标系统酶标系统APAP-BCIPBCIP和和NBTNBT 特点特点特点特点：方便、便宜；：方便、便宜；具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢；具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢；检测后的膜不可重新剥离检测。检测后的膜不可重新剥离检测。第16页/共23页18推推 荐荐对照设置对照设置对照设置对照设置 内参对照内参对照内参对照内参对照 beta-actin/beta-tubulin/GAPDHbeta-actin/beta-tubulin/GAPDH 阳性对照阳性对照阳性对照阳性对照 检测一抗是否正常检测一抗是否正常检测一抗是否正常检测一抗是否正常 阴性对照阴性对照阴性对照阴性对照 检测一抗特异性检测一抗特异性检测一抗特异性检测一抗特异性 空白对照空白对照空白对照空白对照 不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。不加一抗，只加二抗，检测二抗是否发生交叉反应。第17页/共23页二二Western Blot Western Blot 技术常见问题分析技术常见问题分析技术常见问题分析技术常见问题分析19第18页/共23页高背景高背景原因原因解决办法解决办法膜的污染使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损膜漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积封闭液不适合比较尝试不同封闭液封闭不完全延长封闭时间（可4过夜）抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度曝光时间过长缩短曝光时间缓冲液污染使用新配制缓冲液第19页/共23页信号弱或无信号信号弱或无信号原因原因解决办法解决办法抗原量不足增加上样量蛋白质储存过程中降解重新制备样品转膜不完全确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。膜错误选择选择合适膜的孔径：22kD 蛋白选用 0.45m孔径 22kD 蛋白选用 0.22m孔径抗原被封闭液遮蔽优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。抗体增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。曝光时间过短延长曝光时间底物延长底物孵育时间第20页/共23页其其 他他现象现象原因原因解决办法解决办法荧光萃灭快二抗浓度太高膜干燥降低二抗浓度保证膜的湿润度条带内出现不显影圆点转膜过程中有气泡转膜时赶尽气泡条带不完整底物孵育不均匀用保鲜膜均与孵育底物反影（白色条带、黑色背景）HRP浓度过高降低二抗浓度散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀第21页/共23页非特异性条带非特异性条带原因原因解决办法解决办法底物太灵敏选择合适的底物交叉反应选择单克隆抗体抗原浓度太高降低抗原浓度抗体浓度太高降低抗体浓度曝光时间太长减少曝光时间第22页/共23页