实验十一底物浓度对酶促反应速度的影响.docx
实验H一底物浓度对酶促反应速度的影响一、目的验证底物浓度对酶促反应速度的影响，并学习双倒数作图法求Kmo二、原理+0H磷酸苯二钠碱性磷酸酶+磷酸氢二钠苯酚三、主要仪器与试剂(1)恒温水浴箱、试管、移液管、分光光度计二(2)0. hng/ml标准酚液、碱性溶液(0. 5M NaOH)、0. 3% 4-氨基安替 比林、0.5%铁氧化钾、0. 1MPH10碳酸缓冲液、0.04M磷酸苯二钠、碱性磷酸酶。四、操作1、取试管7只，依下表加入各种试剂（ml）：o I nniivvvi0. 04M 磷酸苯二钠 0. 050. 10. 20. 30. 40. 8pH10 碳酸缓冲液 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 0. 7 H20 1. 2 1. 15 1. 11.0 0.9 0.8 0.4 37水浴保温5min,然后各加入0. 1ml碱性磷酸酶液底物终浓度 mM 0 1 2 4 6 8 16 自测值 0D 0. 150 0. 491 0. 7830.812 0. 934 1.074 计时,37水浴保温 15min。注终浓度计算：如II号管，40mM磷酸苯二钠加入O.hnl,试管中 溶液总量2nd,则S磷酸苯二钠二40X0. l/2=2mM2、保温结束，立即加入碱性溶液Ind,终止反应。3、各管中分别加入0.3%的4-氨基安替比林1ml, 0.5%铁氟化钾2ml, 充分混匀，静置昆min。以0号调“0点”，于510nm比色，测得0D值。由测得的0D值，在实验十画出的酚标准曲线上查找酚的含量（ug）, 以酚量代表该试管中酶促反应速度（V）,也代表该试管中酶总活力单位（U）,即在37水浴保温15min产生lug的酚量为1个酉每活单位（U）。预实验测值:酚饱和曲线i nmwvviOD 值 S 12468 酚量(ug)酶活、V12. 52233. 533. 7374、以每管中酶促反应速度(V,即酶活单位、酚含量)做纵坐标，以 底物浓度S为横坐标在坐标纸上作图，此为酚饱和曲线。5、以酶活单位的倒数(即"V、1/酚含量)做纵坐标，以底物浓度 的倒数1/S为横坐标在坐标纸上作图，求碱性磷酸酶的Km值。预实验测值:双倒数法求KmI IIIII1VVVIS12468161/S11/21/41/61/8V ( yg)酶活12.52233. 533.7370. 0270.02960. 0451/V0. 080.0298酚饱和曲线双倒数图形五、安排与要求2人做1份；绘制2表、2图：酚饱和曲线测定的图表、双倒数法求取Km值的图 表。(上面的图表)下次实验请学生自带镶子、剪刀。作业：比色方法测定溶液浓度的基本原理是什么？已知物质标准液浓度测定 溶液未知浓度有几种方法？酶促反应与分光光度法介绍：(一)酶促反应在温度、pH及酶浓度恒定条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大 影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(V )随底物浓 度(S )的增加而增加，但当底物浓度继续增加时,反应速度的增加就比较 小，当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值最大速度 (Vmax)o米氏方程(Michaelis Menten)max S K S V V m +-=米氏常数是反应速度(V )等于最大反应速 度一半时的底物浓度，它是酶的特征性常数。大多数酶的K m值在10- 110-6mol/L 之间。将 Michaelis -Menten 变形成 Lineweaver -Burk 方程式：maxmax 111V S V K V m +-=酶促反应速度单位时间内，单位体积 中底物的减少量或产物的增加量，浓度/单位时间。酶促反应速度仅在最 初阶段保持恒定，随着时间延长酶促反应速度下降：底物浓度I、酶失活、 产物浓度t、产物对酶抑制。底物浓度与酶促反应速度的关系：一级反应（二者正比）一混合级反 应（非正比性增加）一零级反应（V达到极限值，此时酶已被底物饱和）。醮活力指酶催化一定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它 所催化的某一反应的反应速度来表示。测定酶活力就是测定酶促反应速度。（二）分光光度法分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的 一门技术。物质对光的吸收具有选择性，各种不同的物质都具有各自的吸收光谱。 当某单色光通过溶液时，其透射光强会减弱。因为有一部分光在溶液的表 面被反射或散射，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可 透过溶液。入射光二反射光+散射光+吸收光+透射光如果用蒸储水（或组成 此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射、散射等因素造成的入射光的损 失，则：入射光二吸收光+透射光。Lambert-Beer 定律：当一束单色光通过溶液时，光波被吸收一部分，吸收多少与溶液中溶 质的浓度及溶液厚度成正比，这就是Lambert-Beer定律。当入射光、摩 尔吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的。 这是分光光度计设计的基本原理。LCKTI - -01g ；或cl I I £ -100 I 0表示入射光强度;I表示透过光强度；L表示溶液的厚度，也称溶液的光径长度cm ；K、£为消光系数(吸光系数)，表示物质对光的吸收特性，消光 系数值越大，该物质吸收光的能力越强，测定的灵敏度越高，消光系数是 物质对光吸收的特征值。消光系数的表示方法有百分浓度消光系数和摩尔 浓度消光系数。百分浓度消光系数()即以百分浓度来表示的消光系数， 它等于溶液浓度为设、液层厚度为1cm时的光密度值。摩尔浓度消光系 数()即以摩尔浓度来表示的消光系数，它等于溶液浓度为Imol/L、液 层厚度为1cm时的光密度值。%llcm K M cm K 1C为溶液中溶质的浓度；透光度(transmittance ) T = I / I 0,表示光线透过溶液的程度。吸光度(absorbance ) A = lg(l/T ) = lg(I 0/1 ) = KCL ,表示 溶液对光的吸收程度，习惯上也用光密度(optical density , 0D )表Zp* o
