酶的分离和纯化.pptx

会计学1酶的分离和纯化酶的分离和纯化第1页/共40页 第一节第一节 原料选择及预处理原料选择及预处理 n n动动动动物物物物原原原原料料料料：动动动动物物物物组组组组织织织织或或或或脏脏脏脏器器器器（活活活活体体体体取取取取出出出出）充充充充分分分分脱脱脱脱血血血血 -10-10 -5050保存保存保存保存n n植物原料植物原料植物原料植物原料：植物原料：植物原料：植物原料：植物原料 磨碎磨碎磨碎磨碎 加入缓冲液抽提加入缓冲液抽提加入缓冲液抽提加入缓冲液抽提n n植植植植物物物物原原原原料料料料特特特特点点点点：1 1）纤纤纤纤维维维维含含含含量量量量高高高高 2 2）酚酚酚酚酶酶酶酶活活活活力力力力高高高高 3 3）缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液pHpH易易易易被细胞内物质改变被细胞内物质改变被细胞内物质改变被细胞内物质改变n n微微微微生生生生物物物物原原原原料料料料：菌菌菌菌体体体体培培培培养养养养 做做做做酶酶酶酶活活活活时时时时间间间间曲曲曲曲线线线线 确确确确定定定定最最最最大大大大酶酶酶酶活活活活时时时时间间间间 第2页/共40页 细胞破碎细胞破碎 n n微生物细胞破碎一般采用微生物细胞破碎一般采用微生物细胞破碎一般采用微生物细胞破碎一般采用 n n1 1）化化化化学学学学法法法法：碱碱碱碱；去去去去垢垢垢垢剂剂剂剂；有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂；酶酶酶酶解解解解；冰冰冰冰冻冻冻冻复融复融复融复融n n2 2）物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡物理法：热处理；渗透压；减压；声波振荡n n3 3）机械法：加磨料；研磨；挤压机械法：加磨料；研磨；挤压机械法：加磨料；研磨；挤压机械法：加磨料；研磨；挤压n n4 4）缓冲液抽提缓冲液抽提缓冲液抽提缓冲液抽提n n抽抽抽抽提提提提缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液的的的的加加加加入入入入要要要要少少少少量量量量多多多多次次次次，植植植植物物物物酶酶酶酶抽抽抽抽提提提提时时时时可可可可加加加加5mM5mM的的的的VcVc第3页/共40页第二节第二节 酶的粗提酶的粗提n n沉淀沉淀沉淀沉淀 n n核酸沉淀：核酸沉淀：核酸沉淀：核酸沉淀：a a）MnClMnCl2 2、硫酸、硫酸、硫酸、硫酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸鱼精蛋白、链霉素可使核酸沉淀，离心除掉沉淀，离心除掉沉淀，离心除掉沉淀，离心除掉（b b）加入）加入）加入）加入核酸酶将其降解核酸酶将其降解核酸酶将其降解核酸酶将其降解n n杂蛋白沉淀：根据目的酶的杂蛋白沉淀：根据目的酶的杂蛋白沉淀：根据目的酶的杂蛋白沉淀：根据目的酶的特性方法各异特性方法各异特性方法各异特性方法各异n n选择性沉淀（盐析）：最常选择性沉淀（盐析）：最常选择性沉淀（盐析）：最常选择性沉淀（盐析）：最常用的方法用的方法用的方法用的方法第4页/共40页n n沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力沉淀过程中随时监测蛋白浓度和酶活力n n 讨论：讨论：讨论：讨论：n n（a a）盐的加入速度合适）盐的加入速度合适）盐的加入速度合适）盐的加入速度合适n n（b b）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关）蛋白质开始沉淀处的硫铵浓度与蛋白浓度有关n n（c c）硫铵浓度表示法；饱和度）硫铵浓度表示法；饱和度）硫铵浓度表示法；饱和度）硫铵浓度表示法；饱和度25254.1M4.1Mn n（d d）硫硫硫硫铵铵铵铵饱饱饱饱和和和和溶溶溶溶液液液液pH7pH7，若若若若目目目目的的的的酶酶酶酶易易易易酸酸酸酸变变变变性性性性必必必必须须须须用用用用缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液n n（e e）硫铵溶液密度较高（）硫铵溶液密度较高（）硫铵溶液密度较高（）硫铵溶液密度较高（1.241.24），故需较大离心力），故需较大离心力），故需较大离心力），故需较大离心力n n此步可除去此步可除去此步可除去此步可除去75%75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩第5页/共40页 透析与浓缩透析与浓缩 n n1 1）透析袋处理：透析袋处理：透析袋处理：透析袋处理：n n透透透透析析析析袋袋袋袋 0.5M 0.5M EDTAEDTA煮煮煮煮半半半半小小小小时时时时 蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水煮煮煮煮半半半半小小小小时时时时 反复八次反复八次反复八次反复八次 带橡皮手套用镊子拿取带橡皮手套用镊子拿取带橡皮手套用镊子拿取带橡皮手套用镊子拿取n n2 2）透透透透析析析析除除除除盐盐盐盐：200200倍倍倍倍于于于于被被被被透透透透析析析析物物物物；4 4小小小小时时时时换换换换一一一一次次次次透透透透析液；监测电导值析液；监测电导值析液；监测电导值析液；监测电导值n nSephadex Sephadex G25 G25 除除除除盐盐盐盐：柱柱柱柱长长长长50cm50cm；上上上上样样样样小小小小于于于于床床床床体体体体积积积积的的的的20%20%n n3 3）浓缩：浓缩：浓缩：浓缩：a a）火棉胶）火棉胶）火棉胶）火棉胶 b b）聚乙二醇（）聚乙二醇（）聚乙二醇（）聚乙二醇（PEGPEG）n n c c）超滤（）超滤（）超滤（）超滤（3-5kg/cm3-5kg/cm2 2）d d）冻干）冻干）冻干）冻干第6页/共40页 透析技术原理图透析技术原理图透析技术原理图透析技术原理图第7页/共40页 超滤技术原理图超滤技术原理图超滤技术原理图超滤技术原理图 第8页/共40页 第三节第三节 酶的精制酶的精制 一、层析技术（一、层析技术（一、层析技术（一、层析技术（chromatographychromatography）1 1）分配层析分配层析分配层析分配层析：物质在两相中的分配系数不同：物质在两相中的分配系数不同：物质在两相中的分配系数不同：物质在两相中的分配系数不同a a）纸层）纸层）纸层）纸层 b b）薄层）薄层）薄层）薄层(比纸层灵敏比纸层灵敏比纸层灵敏比纸层灵敏100100倍但剥板困难倍但剥板困难倍但剥板困难倍但剥板困难)c c）柱层）柱层）柱层）柱层2 2）吸吸吸吸附附附附层层层层析析析析（absorptionabsorptionchromatographychromatography）：吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂对对对对通通通通过过过过它它它它的的的的物物物物质质质质吸吸吸吸附附附附力力力力不不不不同同同同，吸吸吸吸附附附附力力力力包包包包括括括括离离离离子子子子引引引引力力力力、疏疏疏疏水作用、范德华力和氢键水作用、范德华力和氢键水作用、范德华力和氢键水作用、范德华力和氢键a a）薄层）薄层）薄层）薄层 b b）柱层）柱层）柱层）柱层n n填填填填料料料料一一一一般般般般为为为为硅硅硅硅胶胶胶胶、氧氧氧氧化化化化铝铝铝铝、磷磷磷磷酸酸酸酸钙钙钙钙、活活活活性性性性白白白白土土土土和和和和羟羟羟羟基基基基磷磷磷磷灰灰灰灰石石石石；常常常常用用用用羟羟羟羟基基基基磷磷磷磷灰灰灰灰石石石石;带带带带正正正正电电电电,稳稳稳稳定定定定范范范范围围围围pH5.5-10,pH5.5-10,吸附量吸附量吸附量吸附量1mg/g1mg/g湿剂湿剂湿剂湿剂第9页/共40页纸层纸层第10页/共40页薄层薄层第11页/共40页3 3）离离离离子子子子交交交交换换换换层层层层析析析析（ionionexchangeexchangechromatographychromatography）：交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上带带带带电电电电荷荷荷荷，可可可可根根根根据据据据样样样样品品品品的的的的电电电电荷荷荷荷予予予予以以以以分离分离分离分离n na a）阳离子交换层析）阳离子交换层析）阳离子交换层析）阳离子交换层析 b b）阴离子交换层析）阴离子交换层析）阴离子交换层析）阴离子交换层析 n nc c）离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂的的的的类类类类型型型型：离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂、离离离离子子子子交交交交换换换换纤纤纤纤维素、离子交换凝胶维素、离子交换凝胶维素、离子交换凝胶维素、离子交换凝胶n nd d）实实实实验验验验室室室室常常常常用用用用的的的的离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂：阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂DEAE-DEAE-CelluloseCellulose、DEAE-SephadexDEAE-Sephadex；阳阳阳阳 离离离离 子子子子 交交交交 换换换换 剂剂剂剂 CM-CM-CelluloseCellulose、CM-SephadexCM-Sephadexn ne e）离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂的的的的预预预预处处处处理理理理：去去去去杂杂杂杂质质质质；溶溶溶溶胀胀胀胀；除除除除小小小小颗颗颗颗粒粒粒粒；改型改型改型改型n n阳离子交换剂：阳离子交换剂：阳离子交换剂：阳离子交换剂：碱碱碱碱水水水水酸酸酸酸水水水水平衡平衡平衡平衡n n阴离子交换剂：阴离子交换剂：阴离子交换剂：阴离子交换剂：酸酸酸酸水水水水碱碱碱碱水水水水平衡平衡平衡平衡第12页/共40页n nf f）柱柱柱柱层层层层析析析析：床床床床体体体体积积积积等等等等于于于于2-52-5倍倍倍倍束束束束缚缚缚缚样样样样品品品品需需需需要要要要量量量量；径径径径 高高高高 =1 1 15 15；上上上上样样样样量量量量不不不不超超超超过过过过柱柱柱柱体体体体积积积积的的的的10%10%（*注注注注意意意意上上上上样样样样方方方方法法法法）；洗洗洗洗脱脱脱脱方方方方法法法法有有有有两两两两种种种种不不不不连连连连续续续续梯梯梯梯度度度度洗洗洗洗脱脱脱脱和和和和连连连连续续续续梯梯梯梯度度度度洗洗洗洗脱；分布收集器收集每管脱；分布收集器收集每管脱；分布收集器收集每管脱；分布收集器收集每管2-3ml2-3mln ng g）交交交交换换换换剂剂剂剂后后后后处处处处理理理理：饱饱饱饱和和和和NaClNaCl水水水水酸酸酸酸或或或或碱碱碱碱水水水水平衡平衡平衡平衡第13页/共40页 连续梯度洗脱连续梯度洗脱连续梯度洗脱连续梯度洗脱n n梯度混合器 第14页/共40页离子交换层析离子交换层析n n阳离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂n n阴离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂第15页/共40页AnionexchangechromatographyAnionexchangechromatography 第16页/共40页4 4）凝胶层析（分子筛层析）（凝胶层析（分子筛层析）（凝胶层析（分子筛层析）（凝胶层析（分子筛层析）（gel filtration chromatographygel filtration chromatographygel filtration chromatographygel filtration chromatography）：根据分子量大小予以分离根据分子量大小予以分离根据分子量大小予以分离根据分子量大小予以分离 n na a）凝胶预处理：凝胶）凝胶预处理：凝胶）凝胶预处理：凝胶）凝胶预处理：凝胶浸入洗脱液浸入洗脱液浸入洗脱液浸入洗脱液轻轻搅拌轻轻搅拌轻轻搅拌轻轻搅拌n n n n 加热加热加热加热90-10090-100（水浴加热）（水浴加热）（水浴加热）（水浴加热）n nb b）层层层层析析析析柱柱柱柱准准准准备备备备：2.51002.5100柱柱柱柱；稠稠稠稠胶胶胶胶灌灌灌灌柱柱柱柱；2-32-3个个个个床床床床体体体体积的缓冲液平衡；积的缓冲液平衡；积的缓冲液平衡；积的缓冲液平衡；流速流速流速流速16-18ml/h16-18ml/hn nc c）层层层层析析析析：兰兰兰兰葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖（分分分分子子子子量量量量2102106 6）验验验验柱柱柱柱并并并并求求求求外外外外水水水水体体体体积（积（积（积（V V0 0）；上样量）；上样量）；上样量）；上样量1-5%1-5%；n n恒压洗脱；恒压洗脱；恒压洗脱；恒压洗脱；流速流速流速流速16-18ml/h16-18ml/hn nd d）凝凝凝凝胶胶胶胶后后后后处处处处理理理理：0.5N 0.5N NaOH+0.5N NaOH+0.5N NaClNaCl处处处处理理理理后后后后4 4保存保存保存保存n n长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存长时间不用可采用乙醇脱水保存或低温干燥保存第17页/共40页 凝胶过滤层析原理图凝胶过滤层析原理图凝胶过滤层析原理图凝胶过滤层析原理图 第18页/共40页 Gel filtration chromatographyGel filtration chromatography 第19页/共40页5 5）亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析（affinitychromatographyaffinitychromatography）特异性结合特异性结合特异性结合特异性结合n na a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件n nb b）支支支支持持持持物物物物的的的的选选选选择择择择：非非非非特特特特异异异异性性性性吸吸吸吸附附附附作作作作用用用用低低低低；液液液液体体体体流流流流动动动动性性性性好好好好；较较较较宽宽宽宽的的的的pHpH、离离离离子子子子强强强强度度度度；丰丰丰丰富富富富的的的的化化化化学基团；有效的多孔性学基团；有效的多孔性学基团；有效的多孔性学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球n nc c）配体的选择：有亲和力但不易过大）配体的选择：有亲和力但不易过大）配体的选择：有亲和力但不易过大）配体的选择：有亲和力但不易过大n nd d）配配配配体体体体与与与与支支支支持持持持物物物物的的的的连连连连接接接接：载载载载体体体体结结结结合合合合法法法法；物物物物理理理理吸吸吸吸附附附附法法法法；交交交交联联联联法法法法；包包包包埋埋埋埋法法法法（先先先先活活活活化化化化支支支支持持持持物物物物上上上上的的的的功能基团再将配体连上去）功能基团再将配体连上去）功能基团再将配体连上去）功能基团再将配体连上去）n ne e）吸附剂的衍生物：支持物吸附剂的衍生物：支持物吸附剂的衍生物：支持物吸附剂的衍生物：支持物+空间臂空间臂空间臂空间臂n nf f）层析条件的选择：蛋白质层析条件的选择：蛋白质层析条件的选择：蛋白质层析条件的选择：蛋白质+配体配体配体配体 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质-配体复合物配体复合物配体复合物配体复合物 起起起起初初初初配配配配体体体体浓浓浓浓度度度度恒恒恒恒定定定定，随随随随蛋蛋蛋蛋白白白白浓浓浓浓度度度度增增增增加加加加平平平平衡衡衡衡右右右右移移移移（逐逐逐逐渐渐渐渐保保保保留留留留特特特特性性性性），故故故故亲亲亲亲和和和和力力力力较较较较低低低低也也也也能能能能成成成成功功功功的的的的亲亲亲亲和。和。和。和。g g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件第20页/共40页 亲和层析原理亲和层析原理亲和层析原理亲和层析原理第21页/共40页 Affinity chromatography 第22页/共40页二、二、二、二、超离心技术超离心技术超离心技术超离心技术 利用物质的沉降系数、质量、利用物质的沉降系数、质量、利用物质的沉降系数、质量、利用物质的沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离浮力因子等方面的差别用强离心力进行分离n nF F=w w w w2 2r r （F F 相相相相对对对对离离离离心心心心力力力力RCFRCF；RCFRCF以以以以g g的的的的倍倍倍倍数数数数表表表表示）示）示）示）n n RCF=RCF=w w w w2 2r/980 r/980 w=w=w=w=(转数转数转数转数/分）分）分）分）/30/30/30/30n n RCF=1.11910 RCF=1.11910-5-5 r(r(转数转数转数转数/分分分分)2 2n n离心机：离心机：离心机：离心机：n na)a)桌式：桌式：桌式：桌式：30003000转转转转/分分分分 红血球、酵母细胞等粗沉淀物红血球、酵母细胞等粗沉淀物红血球、酵母细胞等粗沉淀物红血球、酵母细胞等粗沉淀物n nb)b)高高高高速速速速离离离离心心心心机机机机：20000 20000 2500025000转转转转/分分分分 一一一一般般般般实实实实验验验验使使使使用用用用但但但但病毒、小细胞器或单个分子不能沉降病毒、小细胞器或单个分子不能沉降病毒、小细胞器或单个分子不能沉降病毒、小细胞器或单个分子不能沉降n nc)c)超超超超速速速速离离离离心心心心机机机机：7500075000转转转转/分分分分 分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学必必必必备备备备；能能能能分分分分级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器级只有在电镜下才能看得见的亚细胞器第23页/共40页 二、电泳（二、电泳（二、电泳（二、电泳（electrophoresiselectrophoresiselectrophoresiselectrophoresis）技术）技术）技术）技术 n n1 1）原理：原理：原理：原理：M=d L/E tM=d L/E tM:M:迁移率迁移率迁移率迁移率 L:L:颗粒泳动距离颗粒泳动距离颗粒泳动距离颗粒泳动距离 t:t:通电时间通电时间通电时间通电时间 E:E:电势差电势差电势差电势差n n迁迁迁迁移移移移率率率率与与与与下下下下列列列列因因因因素素素素有有有有关关关关：a a）样样样样品品品品带带带带电电电电状状状状态态态态、分分分分子子子子形形形形状与大小状与大小状与大小状与大小 b b）电场强度）电场强度）电场强度）电场强度 c c）缓冲液）缓冲液）缓冲液）缓冲液pHpH的和离子强度的和离子强度的和离子强度的和离子强度 d d）支持介质的阻力、吸附作用）支持介质的阻力、吸附作用）支持介质的阻力、吸附作用）支持介质的阻力、吸附作用n n2 2）电泳类型：）电泳类型：）电泳类型：）电泳类型：a a）纸电泳）纸电泳）纸电泳）纸电泳 b b）醋酸纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳 c c）琼脂糖电泳）琼脂糖电泳）琼脂糖电泳）琼脂糖电泳 d d）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳第24页/共40页PAGEPAGE和和和和SDS-PAGESDS-PAGEn n聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳：Acr+BisAcr+Bis；TEMEDTEMED，0.4%0.4%；过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺过硫酸胺,0.01-0.03%,0.01-0.03%；n n等等等等电电电电聚聚聚聚焦焦焦焦(isoelectric(isoelectricfocusing)focusing)：两两两两性性性性电电电电解解解解质质质质在在在在电电电电场场场场作作作作用下建立一个用下建立一个用下建立一个用下建立一个pHpH梯度分离蛋白质梯度分离蛋白质梯度分离蛋白质梯度分离蛋白质n n电泳检测：电泳检测：电泳检测：电泳检测：a a）考马斯亮兰（氨基黑）染色法）考马斯亮兰（氨基黑）染色法）考马斯亮兰（氨基黑）染色法）考马斯亮兰（氨基黑）染色法 n nb b）荧光染色法）荧光染色法）荧光染色法）荧光染色法 c c）特异酶检测）特异酶检测）特异酶检测）特异酶检测 d d）其他染色法）其他染色法）其他染色法）其他染色法第25页/共40页 盘状电泳（盘状电泳（盘状电泳（盘状电泳（A A）和平板电泳（）和平板电泳（）和平板电泳（）和平板电泳（B B）第26页/共40页 第四节第四节 提纯过程中的定量提纯过程中的定量 n n蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质浓浓浓浓度度度度：1 1）双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法：CuCu+与与与与肽肽肽肽键键键键及及及及酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸残残残残基基基基络络络络合合合合显显显显色；测定浓度色；测定浓度色；测定浓度色；测定浓度0.5-10mg/ml 0.5-10mg/ml n n2 2）LowryLowry法法法法：双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法的的的的改改改改进进进进，CuCu+与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在碱碱碱碱性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中络合，此络合物还原络合，此络合物还原络合，此络合物还原络合，此络合物还原FolinFolin试剂，测定浓度试剂，测定浓度试剂，测定浓度试剂，测定浓度20-400g/ml 20-400g/ml n n3)3)紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收法法法法：TyrTyr、TrpTrp、PhePhe在在在在280nm280nm有有有有最最最最大大大大光光光光吸吸吸吸收收收收，此此此此方方方方法法法法因因因因上上上上述述述述三三三三种种种种氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸含含含含量量量量不不不不同同同同测测测测定定定定结结结结果果果果有有有有误误误误差差差差 测测测测定定定定浓浓浓浓度度度度0.1-0.1-0.5mg/ml0.5mg/mln n4 4）BradfordBradford法法法法:该该该该法法法法是是是是根根根根据据据据蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质与与与与考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮亮蓝蓝蓝蓝（coomassie coomassie brilliant brilliant blueblue）结结结结合合合合产产产产生生生生的的的的蓝蓝蓝蓝色色色色物物物物质质质质在在在在595nm595nm有有有有最最最最大大大大光光光光吸吸吸吸收收收收来来来来测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质浓浓浓浓度度度度的的的的。该该该该方方方方法法法法简简简简单单单单、快快快快速速速速、可可可可靠靠靠靠、灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高，可测定可测定可测定可测定1-101-10m m m mg g的蛋白质。的蛋白质。的蛋白质。的蛋白质。n n酶活力：检测目的酶的活力酶活力：检测目的酶的活力酶活力：检测目的酶的活力酶活力：检测目的酶的活力n n目的蛋白（非酶）检测较困难目的蛋白（非酶）检测较困难目的蛋白（非酶）检测较困难目的蛋白（非酶）检测较困难第27页/共40页纯化倍数纯化倍数 =回收率回收率%=%=100100 第28页/共40页 酶的提纯过程记录格式酶的提纯过程记录格式酶的提纯过程记录格式酶的提纯过程记录格式 步骤步骤总体积总体积（ml）蛋白蛋白总量总量（mg）总活总活力力（u）比活比活力力（u/mg）回收回收率率（%）提提纯纯倍倍数数粗抽提液粗抽提液50热变性除杂热变性除杂硫铵分级沉淀硫铵分级沉淀（30%-50%）DEAE-纤维素纤维素离子交换离子交换凝胶过滤凝胶过滤SephadexG-100100010002502510120008000750359.25000480002730182017000.4160.803.6752185100965536.4341.001.448.83125444第29页/共40页第五节第五节 酶蛋白分子量的测定酶蛋白分子量的测定n n渗透压法渗透压法n n超速离心法超速离心法n n凝胶层析法凝胶层析法 n nSDS-聚丙烯酰胺电泳法聚丙烯酰胺电泳法 第30页/共40页 渗透压法渗透压法n nMM为为为为蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的摩摩摩摩尔尔尔尔质质质质量量量量（分分分分子子子子量量量量），R R为为为为气气气气体体体体常常常常数数数数（0.0820.082升升升升 大大大大气气气气压压压压/摩摩摩摩尔尔尔尔/度度度度），T T为为为为绝绝绝绝对对对对温温温温度度度度。为为为为了了了了测测测测定定定定蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的分分分分子子子子量量量量，分分分分别别别别取取取取几几几几个个个个不不不不同同同同的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质浓浓浓浓度度度度c c，测测测测出出出出对对对对应应应应的的的的渗渗渗渗透透透透压压压压，然然然然后后后后以以以以/c/c对对对对c c作作作作图图图图，并并并并作作作作延延延延长长长长线线线线外外外外推推推推至至至至c=0c=0，得得得得到到到到的的的的y y轴轴轴轴截截截截距距距距即即即即为为为为lim/clim/c的的的的值值值值，代代代代入入入入上上上上式式式式可可可可求得分子量求得分子量求得分子量求得分子量MM。n n渗渗渗渗透透透透压压压压法法法法适适适适合合合合测测测测定定定定分分分分子子子子量量量量范范范范围围围围在在在在10,00010,000100,000100,000的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质。其其其其优优优优点点点点是是是是实实实实验验验验装装装装置置置置简简简简单单单单，测测测测定定定定也也也也较较较较为为为为准准准准确确确确；缺缺缺缺点点点点是是是是要要要要求求求求蛋蛋蛋蛋白白白白样样样样品品品品纯纯纯纯度度度度高高高高，否否否否则则则则测测测测出出出出的的的的将将将将是是是是溶液中各种蛋白的平均分子量。溶液中各种蛋白的平均分子量。溶液中各种蛋白的平均分子量。溶液中各种蛋白的平均分子量。第31页/共40页超速离心法超速离心法n nMM：分分分分子子子子量量量量 S S：沉沉沉沉降降降降系系系系数数数数 R R：气气气气体体体体常常常常数数数数 T T：绝绝绝绝对对对对温温温温度度度度 DD：扩扩扩扩散散散散系系系系数数数数 ：溶溶溶溶质质质质分分分分子子子子微微微微分分分分比比比比容容容容 ：介质密度：介质密度：介质密度：介质密度第32页/共40页 SDS-聚丙烯酰胺电泳法聚丙烯酰胺电泳法M M 被测蛋白分子量被测蛋白分子量被测蛋白分子量被测蛋白分子量a a，b b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得 de de 酶蛋白的泳动距离酶蛋白的泳动距离酶蛋白的泳动距离酶蛋白的泳动距离 do do 小分子染料的泳动距离小分子染料的泳动距离小分子染料的泳动距离小分子染料的泳动距离n n亚基分子量亚基分子量亚基分子量亚基分子量第33页/共40页 SDS-PAGE SDS-PAGE的分子量标准曲线的分子量标准曲线的分子量标准曲线的分子量标准曲线 第34页/共40页 凝胶层析法凝胶层析法M M 被测蛋白分子量被测蛋白分子量被测蛋白分子量被测蛋白分子量a a，b b 常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得常数，用已知分子量蛋白作标准曲线求得 Ve Ve 酶蛋白洗脱体积酶蛋白洗脱体积酶蛋白洗脱体积酶蛋白洗脱体积 Vo Vo 空体积（可用蓝葡聚糖求得）空体积（可用蓝葡聚糖求得）空体积（可用蓝葡聚糖求得）空体积（可用蓝葡聚糖求得）第35页/共40页 凝胶过滤分子量标准曲线凝胶过滤分子量标准曲线凝胶过滤分子量标准曲线凝胶过滤分子量标准曲线 第36页/共40页思考题思考题n n下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。下表是一种酶的各个纯化步骤的总蛋白和总活性单位数。从从从从表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活；表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活；表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活；表中给出的信息计算每一纯化步骤得到的酶溶液的比活；n n哪一纯化步骤最有效（即相对纯度增加最大）；哪一纯化步骤最有效（即相对纯度增加最大）；哪一纯化步骤最有效（即相对纯度增加最大）；哪一纯化步骤最有效（即相对纯度增加最大）；n n哪一纯化步骤效率最低？哪一纯化步骤效率最低？哪一纯化步骤效率最低？哪一纯化步骤效率最低？n n按按按按照照照照表表表表中中中中的的的的6 6 6 6个个个个步步步步骤骤骤骤纯纯纯纯化化化化的的的的酶酶酶酶是是是是纯纯纯纯化化化化的的的的酶酶酶酶，表表表表中中中中结结结结果果果果是是是是否否否否有有有有指指指指示示示示？有没有别的方法评价酶的纯度？有没有别的方法评价酶的纯度？有没有别的方法评价酶的纯度？有没有别的方法评价酶的纯度？第37页/共40页第38页/共40页作作 业业n n请请说说明明酶酶纯纯化化过过程程中中常常用用的的分分离离技技术术。从从肝肝细细胞胞中中提提取取的的一一种种蛋蛋白白水水解解酶酶的的粗粗提提液液300mL含含有有150mg蛋蛋白白质质，总总活活力力为为360单单位位。经经过过一一系系列列纯纯化化步步骤骤以以后后得得到到的的4mL酶酶制制品品（含含有有0.08mg蛋蛋白白），总总活活力力为为288单单位位。整整个个纯纯化化过过程程的的收收率是多少？纯化了多少倍？率是多少？纯化了多少倍？第39页/共40页