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会计学1细胞培养绪论细胞培养绪论第一章第一章 绪绪 论论 第1页/共54页 细细胞胞是是一一切切生生命命现现象象的的基基石石和和载载体体，事事实实上上人人体体诸诸多多的的奥奥秘秘，包包括括生生理理的的和和病病理理的的都都是是从从细细胞胞的的活活动动中中揭揭示示出出来来。细细胞胞的的信信息息传传递递、代代谢谢、增增殖殖、遗遗传传、变变异异、分分化化、疾疾病病、衰衰老老和和死死亡亡等等无无一一不不是是整整个机体生命过程的反映，甚至是缩影。个机体生命过程的反映，甚至是缩影。细胞的发现和细胞学的创立是细胞的发现和细胞学的创立是“十九世纪三大发十九世纪三大发现之一现之一”；“每一个生物学问题的关键最终必然从每一个生物学问题的关键最终必然从细胞中去寻找细胞中去寻找”。研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，研究细胞有多种方式、多条途径以及不同层次，但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其但最重要的是对单个或群体细胞的观察与分析。其中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反中细胞培养几乎可以最直接、最简单和最准确地反第2页/共54页 映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体映生命的各种活动规律，以及部分地提供在机体 中发生的各种信息。中发生的各种信息。中发生的各种信息。中发生的各种信息。细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，细胞培养是一门技术，包含有诸多方面的知识，涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动涉及细胞生物学、生物化学、分子生物学、动物学与植物学、病原学、遗传学、肿瘤学、生物学与植物学、病原学、遗传学、肿瘤学、生物学与植物学、病原学、遗传学、肿瘤学、生物学与植物学、病原学、遗传学、肿瘤学、生物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习物工程学甚至光学、物理学等学科，因此学习细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时细胞培养应有一定的其他学科的知识，操作时刻不忘刻不忘刻不忘刻不忘“无菌无菌无菌无菌”概念。概念。概念。概念。第3页/共54页一、体外培养的概念一、体外培养的概念体外培养技术是一门以模拟体内生长条件为体外培养技术是一门以模拟体内生长条件为基础而建立的基础而建立的“活体活体”实验技术。其相对于体实验技术。其相对于体内试验，具有能够简化细胞生长环境、明确生内试验，具有能够简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测结果以及方便控制培养产物等优点。接观测结果以及方便控制培养产物等优点。第4页/共54页 体体体体外外外外培培培培养养养养(in in vitrovitro culture)culture)：是是是是将将将将活活活活体体体体结结结结构构构构成成成成分分分分(如如如如活活活活体体体体组组组组织织织织、活活活活体体体体细细细细胞胞胞胞或或或或活活活活体体体体器器器器官官官官等等等等)甚甚甚甚或或或或活活活活的的的的个个个个体体体体从从从从体体体体内内内内或或或或其其其其寄寄寄寄生生生生体体体体内内内内取取取取出出出出，模模模模拟拟拟拟体体体体内内内内的的的的生生生生理理理理环环环环境境境境，在在在在无无无无菌菌菌菌、适适适适当当当当温温温温度度度度和和和和一一一一定定定定营营营营养养养养条条条条件件件件下下下下使使使使之之之之存存存存活活活活和和和和生生生生长发育的方法。长发育的方法。长发育的方法。长发育的方法。按按按按照照照照体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的结结结结构构构构成成成成分分分分，可可可可将将将将体体体体外外外外培培培培养养养养人人人人为为为为分为：分为：分为：分为：组织培养组织培养组织培养组织培养(tissue culture)(tissue culture)细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养(cell culture)(cell culture)器官培养器官培养器官培养器官培养(organ culture)(organ culture)第5页/共54页组织培养组织培养:指从生物体内取出活的组织指从生物体内取出活的组织(多指组织块）在体外进行培养的方法。多指组织块）在体外进行培养的方法。组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。组织培养的对象在体外可以发生分化并保持组织的结构和功能，但不具备器官的结构和功能特点。细胞培养细胞培养：指将活细胞：指将活细胞(尤其是分散的细胞尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。在体外进行培养的方法。细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组织。包括单细胞的培养、细胞克隆化培养。细胞培养强调在培养过程中分散的细胞不在形成组织。包括单细胞的培养、细胞克隆化培养。器官培养器官培养：指从生物体内取出活的器官：指从生物体内取出活的器官(一般是胚胎器官一般是胚胎器官)、器官的一部分在体外进行培养的方法。、器官的一部分在体外进行培养的方法。器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。器官培养的对象在体外环境下也可能发生一定程度的分化，但始终保持器官的基本结构和功能特征。事实上，三种培养方法没有截然的界限。事实上，三种培养方法没有截然的界限。第6页/共54页第7页/共54页 组组织织培培养养过过程程中中，培培养养组组织织不不能能在在体体外外长长期期维维持持其其结结构构和和功功能能，培培养养的的时时间间长长，经经过过反反复复传传代代，细细胞胞出出现现单单一一化化现现象象趋趋向向单单一一类类型型的的细细胞胞最最终终成成为为细细胞胞培培养养。同同样样细细胞胞在在体体外外培培养养时时也也是是相相互互依依存存的的，而而不不是是各各自自为为政政，表表现现为为一一定定的的“组组织织”特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。特征，故组织培养和细胞培养实为同义词。是否有体内培养是否有体内培养(in vivoculture)？第8页/共54页 体内培养体内培养(invivoculture)：将活体结将活体结构成分构成分(如活体组织、活体细胞、活体器官等如活体组织、活体细胞、活体器官等)甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放甚至活的个体从体内或其寄生体内取出，放在其他生物体内让其生长和发育的方法。在其他生物体内让其生长和发育的方法。最常见的体内培养方式就是移植最常见的体内培养方式就是移植(trans-Plantation)。第9页/共54页二、体外培养技术的发展历史二、体外培养技术的发展历史 1919世世世世纪纪纪纪后后后后叶叶叶叶实实实实验验验验胚胚胚胚胎胎胎胎学学学学的的的的兴兴兴兴起起起起拉拉拉拉开开开开了了了了体体体体外外外外培培培培养养养养技技技技术术术术的的的的序幕，一些著名实验如下：序幕，一些著名实验如下：序幕，一些著名实验如下：序幕，一些著名实验如下：18591859年年年年，法法法法国国国国解解解解剖剖剖剖学学学学家家家家VulpainVulpain最最最最早早早早尝尝尝尝试试试试将将将将蛙蛙蛙蛙胚胚胚胚尾尾尾尾部部部部组组组组织织织织切切切切下下下下，放放放放到到到到普普普普通通通通水水水水内内内内进进进进行行行行“培培培培养养养养”，结结结结果果果果观观观观察察察察到到到到了了了了生生生生长长长长和和和和分化现象。分化现象。分化现象。分化现象。18851885年年年年，德德德德国国国国人人人人RouxRoux用用用用温温温温热热热热的的的的生生生生理理理理盐盐盐盐水水水水在在在在体体体体外外外外使使使使鸡鸡鸡鸡胚胚胚胚髓髓髓髓板板板板组组组组织织织织存存存存活活活活了了了了数数数数天天天天，被被被被认认认认为为为为是是是是体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的萌萌萌萌芽芽芽芽实实实实验验验验，他他他他首次提出组织培养这一概念。首次提出组织培养这一概念。首次提出组织培养这一概念。首次提出组织培养这一概念。18871887年年年年，ArnoldArnold将将将将赤赤赤赤杨杨杨杨髓髓髓髓质质质质小小小小片片片片在在在在蛙蛙蛙蛙的的的的体体体体液液液液中中中中浸浸浸浸过过过过，然然然然后后后后将将将将木木木木片片片片分分分分别别别别种种种种植植植植到到到到蛙蛙蛙蛙的的的的皮皮皮皮下下下下或或或或腹腹腹腹腔腔腔腔内内内内，木木木木片片片片被被被被白白白白细细细细胞胞胞胞浸浸浸浸润润润润后后后后，于于于于种种种种植植植植后后后后不不不不同同同同时时时时间间间间将将将将木木木木片片片片取取取取出出出出并并并并置置置置于于于于温温温温盐盐盐盐水水水水中中中中，观观观观察到有白细胞从木片迁移到盐水中，且能短期存活。察到有白细胞从木片迁移到盐水中，且能短期存活。察到有白细胞从木片迁移到盐水中，且能短期存活。察到有白细胞从木片迁移到盐水中，且能短期存活。第10页/共54页 18971897年，年，年，年，LoebLoeb首次在含有少量血浆凝块的试首次在含有少量血浆凝块的试首次在含有少量血浆凝块的试首次在含有少量血浆凝块的试管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，管中培养成年兔的肝、肾、甲状腺与卵巢植块，发现这些植块在发现这些植块在发现这些植块在发现这些植块在3d3d内仍能保持正常的组织学结构。内仍能保持正常的组织学结构。内仍能保持正常的组织学结构。内仍能保持正常的组织学结构。被认为是器官培养的最早尝试。被认为是器官培养的最早尝试。被认为是器官培养的最早尝试。被认为是器官培养的最早尝试。19031903年，年，年，年，JollyJolly用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外用悬滴法将蝾螈的白细胞在体外维持存活了近一个月时间。维持存活了近一个月时间。维持存活了近一个月时间。维持存活了近一个月时间。19061906年，年，年，年，BeebeBeebe和和和和 EwingEwing以盖片悬滴培养法用以盖片悬滴培养法用以盖片悬滴培养法用以盖片悬滴培养法用动物血清培养狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约动物血清培养狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约动物血清培养狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约动物血清培养狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了约72h.72h.第11页/共54页（一）体外培养技术的创立（一）体外培养技术的创立1907年，实验胚胎学家年，实验胚胎学家RHarrison在研究神经突起的在研究神经突起的起源时进行了一项著名的体外培养实验：起源时进行了一项著名的体外培养实验：实验对象：蛙胚髓管部的小片组织实验对象：蛙胚髓管部的小片组织营养成分：蛙的淋巴液营养成分：蛙的淋巴液实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法实验方法：盖玻片覆盖凹窝悬滴培养法实验结果：将实验结果：将蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久，并蛙胚髓管部的小片组织在体外培养了数周之久，并观察到有神经突起从种植的神经组观察到有神经突起从种植的神经组织块长出。织块长出。贡贡献：献：Harrison的工作较为完善地建立了的工作较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术了体外培养活体组织的结果。被公认为是体外培养技术的开始，的开始，标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经细胞长出的这一重大理论经突起是由神经细胞长出的这一重大理论的诞生。的诞生。第12页/共54页第13页/共54页 19101910年年年年，A A CarrelCarrel在在在在没没没没有有有有抗抗抗抗生生生生素素素素的的的的情情情情况况况况下下下下，仅仅仅仅靠靠靠靠小小小小心心心心细细细细致致致致的的的的无无无无菌菌菌菌操操操操作作作作，连连连连续续续续培培培培养养养养鸡鸡鸡鸡胚胚胚胚心心心心脏脏脏脏植植植植块块块块长长长长达达达达数数数数年年年年之之之之久久久久。CarrelCarrel对体外培养的对体外培养的对体外培养的对体外培养的贡献：贡献：贡献：贡献：将将将将无菌操作观念引入体外培养过程中。无菌操作观念引入体外培养过程中。无菌操作观念引入体外培养过程中。无菌操作观念引入体外培养过程中。将将将将培培培培养养养养组组组组织织织织包包包包埋埋埋埋技技技技术术术术、营营营营养养养养供供供供应应应应以以以以及及及及继继继继续续续续培培培培养养养养(也也也也称称称称传传传传代代代代或或或或继继继继代代代代培培培培养养养养)等等等等许许许许多多多多重重重重要要要要的的的的培培培培养养养养条条条条件件件件和和和和方方方方法法法法引引引引入入入入盖盖盖盖玻玻玻玻片悬滴培养系统，从而完善了片悬滴培养系统，从而完善了片悬滴培养系统，从而完善了片悬滴培养系统，从而完善了HarrisonHarrison的方法。的方法。的方法。的方法。发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。第14页/共54页 19101910年，美国医生年，美国医生年，美国医生年，美国医生MT BurrowsMT Burrows对悬滴培养法对悬滴培养法对悬滴培养法对悬滴培养法的改进的改进的改进的改进:用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，用血浆凝块替代蛙淋巴凝块包埋要培养的组织，延长了组织在体外存活的时间。延长了组织在体外存活的时间。延长了组织在体外存活的时间。延长了组织在体外存活的时间。与与与与CarrelCarrel合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，合作，致力于发展哺乳动物组织的培养，证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。证明体外培养细胞的寿命可以因传代而延长。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。胚胎浸液与血浆混合使用，培养物可以活的更好。通过通过通过通过CarrelCarrel等学者的工作，使得体外连续营养等学者的工作，使得体外连续营养等学者的工作，使得体外连续营养等学者的工作，使得体外连续营养供应和传代成为可能。供应和传代成为可能。供应和传代成为可能。供应和传代成为可能。现在一般认为体外培养技术是从现在一般认为体外培养技术是从现在一般认为体外培养技术是从现在一般认为体外培养技术是从HarrisonHarrison和和和和CarrelCarrel真正开始的。真正开始的。真正开始的。真正开始的。第15页/共54页 19251925年，年，年，年，MaximovMaximov对悬滴培养法作了改进，创造了对悬滴培养法作了改进，创造了对悬滴培养法作了改进，创造了对悬滴培养法作了改进，创造了“双盖双盖双盖双盖玻片法玻片法玻片法玻片法”，可以更好地防止污染，也更适用于神经组织，可以更好地防止污染，也更适用于神经组织，可以更好地防止污染，也更适用于神经组织，可以更好地防止污染，也更适用于神经组织的培养。的培养。的培养。的培养。两位美国科学家两位美国科学家两位美国科学家两位美国科学家W.H.LewisW.H.Lewis和和和和M.R.LewisM.R.Lewis最先试用已知成最先试用已知成最先试用已知成最先试用已知成分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，分的合成培养基取代不能准确确定其成分的天然培养基，由于他们和其它许多科学家在此后由于他们和其它许多科学家在此后由于他们和其它许多科学家在此后由于他们和其它许多科学家在此后3030多年的努力，最终多年的努力，最终多年的努力，最终多年的努力，最终发展出许多合成培养基。发展出许多合成培养基。发展出许多合成培养基。发展出许多合成培养基。剑桥大学剑桥大学剑桥大学剑桥大学StrangewaysStrangeways实验室的实验室的实验室的实验室的Honor FellHonor Fell完善了组织和完善了组织和完善了组织和完善了组织和器官，乃至整个胚胎的体外培养方法器官，乃至整个胚胎的体外培养方法器官，乃至整个胚胎的体外培养方法器官，乃至整个胚胎的体外培养方法(表玻皿器官培养表玻皿器官培养表玻皿器官培养表玻皿器官培养法法法法)。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植。借此保持它们正常的组织学结构，并防止从外植物新长出的细胞生长紊乱。物新长出的细胞生长紊乱。物新长出的细胞生长紊乱。物新长出的细胞生长紊乱。FellFell及其同事使用此技术培及其同事使用此技术培及其同事使用此技术培及其同事使用此技术培养骨和关节组织，为我们提供了大量有关这些组织发育养骨和关节组织，为我们提供了大量有关这些组织发育养骨和关节组织，为我们提供了大量有关这些组织发育养骨和关节组织，为我们提供了大量有关这些组织发育的知识。的知识。的知识。的知识。第16页/共54页（二）体外培养技术的发展（二）体外培养技术的发展u发展主要包括：发展主要包括：探讨体外培养的营养条件探讨体外培养的营养条件 试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。试图建立化学成分明确的人工合成培养基配方以代替成分不明确的天然物质。最终导致人工合成培养基的诞生。试图培养不同类别的生物体组织细胞试图培养不同类别的生物体组织细胞 19131913年，年，SteinhardSteinhard以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘苗病毒，为体外培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。以血浆凝块悬滴培养法分离培养痘苗病毒，为体外培养技术在病毒学上的应用奠定了基础。19151915年，年，GoldschmidtGoldschmidt最早进行无脊椎动物组织的体外培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。最早进行无脊椎动物组织的体外培养，成功培养了鳞翅目昆虫组织。建立不同的培养技术建立不同的培养技术第17页/共54页u发展时期：以发展时期：以20世纪世纪50年代为界分为三个时期年代为界分为三个时期50年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期年代前是培养技术在多个领域广泛发展的时期1933 年，年，GOGey创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如创立了旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系。如1951 年年Gey等以肿瘤组织为材料成功建立了等以肿瘤组织为材料成功建立了Hela细胞系。细胞系。1948 年，年，KKSanford创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能。创立了分离细胞培养法，第一次成功地从单层细胞分离出单个细胞，使得建立遗传性状相同的细胞株成为可能。1949 年，年，Polge等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的细胞。等发现了甘油能够用于保护低温下贮存的细胞。第18页/共54页50年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继年代是培养技术迅猛发展时期，多种培养技术相继被建立被建立1950年，年，JFMorgan等提出等提出199配方。配方。1951年，年，JEShannon和和Earle建立建立T瓶（瓶（Earle瓶）培养法。瓶）培养法。CMPomerat改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，改良和设计了结构简单且易于消毒的灌流小室，使得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。使得体外培养的细胞能在不断更新的培养液中生长。1954年，年，Earle等建立了悬浮培养法。等建立了悬浮培养法。1955年，年，HEagle等建立著名的等建立著名的Eagle培养基配方。培养基配方。1957年，年，Dulbecco等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以等开始采用胰蛋白酶消化处理来分离细胞的方法以及应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。及应用液体培养基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。1959年，年，Lovelock等发现了一种新的化学冷冻保护剂等发现了一种新的化学冷冻保护剂-二甲基亚砜。二甲基亚砜。1960年，年，GBarski等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细等在两种不同类型的细胞混合培养物中，发现不同细胞间存在自发融合现象。胞间存在自发融合现象。第19页/共54页第20页/共54页50年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合年代后是体外培养技术与生命科学其它技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、微生物制药技术、基因转染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。以体外培养技术为基础的应用杂交瘤技术制备单克隆抗体的技术、动物细胞大规模培养技术、微生物制药技术、基因转染与细胞融合以及细胞转化等细胞工程技术。1967 年，年，ALVanWezel创立了微载体技术用于体外大规模培养。创立了微载体技术用于体外大规模培养。1972 年，年，RAKnazek等创立了中空纤维细胞培养技术，模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的等创立了中空纤维细胞培养技术，模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管毛细血管”中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生长条件进行体外培养的新阶段。中空纤维给体外培养的细胞提供物质代谢条件。标志着体外培养技术从过去以二维生长条件跨越到以三维生长条件进行体外培养的新阶段。第21页/共54页 现代组织培养的三个阶段现代组织培养的三个阶段第一阶段第一阶段悬滴培养悬滴培养悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支悬滴培养法具有简便的特点，其次由于培养基中有纤维蛋白构成的支架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不仅架，可供细胞向四面八方生长，培养物是立体的。在此环境中，细胞不仅能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。能增殖生长，也能发生分化，如心肌发生搏动等。缺陷：空间狭小、气体不足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不方缺陷：空间狭小、气体不足、培养液少、难以大量繁殖细胞，观察不方便等。便等。第二阶段第二阶段单层培养单层培养单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距单层细胞培养和体内细胞比仍然有很大差距(缺少细胞基质、血液供缺少细胞基质、血液供应、调控因子应、调控因子)。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立。细胞只有长和宽二维结构，大多细胞会失去原体内时立体的形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功能体的形态，也是细胞生物学性状发生改变的主要原因。细胞在形态、功能上与体内时不同，多数不能充分表达原基因产物。上与体内时不同，多数不能充分表达原基因产物。第三阶段第三阶段三维培养三维培养(立体培养立体培养)为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，为培养细胞提供与体内相似的支架系统，创建与原体内类似的条件，不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。不仅能促进细胞增殖，也可使细胞发生分化和表达体内时的某些产物。第22页/共54页u现代组织培养的重要标志：现代组织培养的重要标志：培养液的改变培养液的改变培养容器的改变培养容器的改变培养方法的改进：培养方法的改进：1948年年Sanford创立了单细胞分离培养法创立了单细胞分离培养法1957年蛋白酶消化组织，分离细胞年蛋白酶消化组织，分离细胞液体培养基的应用液体培养基的应用细细胞胞培培养养用用的的多多种种材材料料都都已已商商品品化化、规规范范化化和和系列化。系列化。低低温温冷冷冻冻技技术术的的应应用用，可可将将已已建建立立的的多多种种细细胞胞系系和细胞株长期冻存。和细胞株长期冻存。第23页/共54页 细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养技技技技术术术术更更更更加加加加广广广广泛泛泛泛地地地地用用用用于于于于生生生生物物物物学学学学和和和和医医医医学学学学研研研研究究究究(如如如如分分分分子子子子遗遗遗遗传传传传学学学学、分分分分子子子子生生生生物物物物学学学学和和和和细细细细胞胞胞胞工工工工程程程程等等等等学科均与细胞培养技术密切相关学科均与细胞培养技术密切相关学科均与细胞培养技术密切相关学科均与细胞培养技术密切相关)如：如：如：如：应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。应用理化因素诱发出遗传缺陷细胞株。利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备利用细胞技术，用杂交瘤细胞制备McAb McAb 用用用用细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养检检检检测测测测环环环环境境境境中中中中可可可可疑疑疑疑致致致致癌癌癌癌物物物物，癌癌癌癌基基基基因转染和细胞转化等。因转染和细胞转化等。因转染和细胞转化等。因转染和细胞转化等。基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的生生生生产产产产手手手手段段段段，用用用用于于于于生生生生产产产产多多多多种种种种生生生生物物物物制品。制品。制品。制品。第24页/共54页（三）我国细胞培养技术的发展（三）我国细胞培养技术的发展20世纪世纪30年代细胞培养传入我国，年代细胞培养传入我国，50年代以后组织培养年代以后组织培养在我国逐渐开展起来。在我国逐渐开展起来。李继侗、沈同李继侗、沈同(银杏胚胎的培养银杏胚胎的培养)、罗宗洛和罗士伟、罗宗洛和罗士伟(玉米根尖生长锥的培养玉米根尖生长锥的培养)是植物组织培养的先驱者。是植物组织培养的先驱者。细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养引入我国。细胞学家张钧、鲍鉴清和杨敷海等则最早将动物组织培养引入我国。病毒分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等病毒分离培养：汤飞凡、郭辉玉、顾方舟等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等昆虫组织培养：高尚荫、刘年翠等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等肿瘤培养：曾毅、鄂征、潘琼婧、何申、姚开泰等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等神经细胞培养：鲍璇、邵文钊、郭畹华等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等干细胞培养：姚鑫、吴祖泽等第25页/共54页三、体外培养技术的主要类别三、体外培养技术的主要类别按照体外培养的对象，可分为按照体外培养的对象，可分为全部培养全部培养和部分和部分培养两大类：培养两大类：全部培养：全部培养：指对生物个体进行培养。对象一般是微指对生物个体进行培养。对象一般是微小的生物个体，如微生物、寄生虫等。小的生物个体，如微生物、寄生虫等。部分培养：部分培养：指对生物个体的一部分进行培养的技术。指对生物个体的一部分进行培养的技术。组织培养、器官培养、细胞培养组织培养、器官培养、细胞培养第26页/共54页四、体外培养技术的应用四、体外培养技术的应用在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、发育潜能、胚胎致畸作用、环境诱变等衍生、演化生长行为及其机制的重要手段。在组织学与胚胎学上的应用：培养胚胎器官，研究其分化和发育过程。是研究胚胎发生、发育过程中诱导现象、发育潜能、胚胎致畸作用、环境诱变等衍生、演化生长行为及其机制的重要手段。在细胞生物学上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生理、细胞遗传学研究。在细胞生物学上的应用：广泛由于细胞形态学、细胞生理、细胞遗传学研究。肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究肿瘤学方面的研究：肿瘤细胞生物学特性研究肿瘤发病机制研究肿瘤发病机制研究异种移植研究异种移植研究第27页/共54页在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在微生物学领域的应用：病毒学、细菌学在免疫学方面的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在免疫学方面的应用：抗体的产生、单克隆抗体的制备在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测在药理学领域的应用：药物筛选、细胞毒性和活性检测动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用：疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等动物细胞与微生物大规模培养技术在生产实践上的应用：疫苗、单克隆抗体、干扰素、激素、生长因子、酶制剂等在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、器官移植等。在现代医学领域的应用：以培养细胞移植修复骨和软骨缺损、体外受精产生试管婴儿、转基因动物、干细胞移植、器官移植等。第28页/共54页五、对体外培养技术的评价五、对体外培养技术的评价 能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多能长时间直接观察活细胞的形态结构和功能活动，是多学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学科进行科学研究的对象和工具，如细胞学、遗传学、免疫学和肿瘤学等。学和肿瘤学等。学和肿瘤学等。学和肿瘤学等。供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组供研究的细胞种类极为广泛，从低等生物到人，或正常组织或肿瘤组织细胞，而且便于记录织或肿瘤组织细胞，而且便于记录织或肿瘤组织细胞，而且便于记录织或肿瘤组织细胞，而且便于记录(通过摄影、闭路电视和摄通过摄影、闭路电视和摄通过摄影、闭路电视和摄通过摄影、闭路电视和摄电影等方式电影等方式电影等方式电影等方式)易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实易施加理化因素和生物因素进行实验研究。如研究某种实验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加验因素对细胞的生物学作用，只需在培养液中有针对性地加入或删除该成分即可。入或删除该成分即可。入或删除该成分即可。入或删除该成分即可。第29页/共54页可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。可同时方便获得大量细胞类型单一、细胞周期同步、生物学性状基本相同并对实验因素反应一致的细胞群。能够进行大规模生物制品的生产。利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。能够进行大规模生物制品的生产。利用体外培养技术可以大量繁殖动物细胞或微生物以生产生物制品。与体内环境相比，体外培养细胞在一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论与体内环境相比，体外培养细胞在一定程度上失去了组织联系及相互作用，缺乏在体内时的血运和神经体液调节作用，因此不能将体外实验结果一并推至体内，即不能轻易下结论。第30页/共54页1.Anchorage-dependent cells or cultures(贴壁依赖性细胞或培养物贴壁依赖性细胞或培养物贴壁依赖性细胞或培养物贴壁依赖性细胞或培养物)：体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的体外培养的细胞只有贴附在不起化学作用的物体的表面时才能生长、生存或维持功能。物体的表面时才能生长、生存或维持功能。物体的表面时才能生长、生存或维持功能。物体的表面时才能生长、生存或维持功能。2.Apoptosis 2.Apoptosis(细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡)：是指细胞内死亡程序的：是指细胞内死亡程序的：是指细胞内死亡程序的：是指细胞内死亡程序的启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为启动而导致细胞自杀的过程，因此也常称为程序性细胞死亡程序性细胞死亡程序性细胞死亡程序性细胞死亡(programmed cell death)programmed cell death)。细。细。细。细胞凋亡与机体正胞凋亡与机体正胞凋亡与机体正胞凋亡与机体正常发育、形态形成常发育、形态形成以及多余细胞的清除等生理以及多余细胞的清除等生理过程密切相关，所以被认为过程密切相关，所以被认为是一种积极的生理性死亡。是一种积极的生理性死亡。六、组织培养常用术语六、组织培养常用术语第31页/共54页3.Cellculture(细胞培养细胞培养)：细胞在体外条件下：细胞在体外条件下的生长。的生长。4.Cellfusion(细胞融合细胞融合)：体外培养条件下，：体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使同种或不同种的种的2个或个或2个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。个以上体细胞融合产生杂交细胞的过程。5.cellgenerationtime(细胞一代时间细胞一代时间)：是指：是指单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微镜电影照相术来精确确定。电影照相术来精确确定。6.Primaryculture（原代培养）：是指直接取（原代培养）：是指直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。自生物体细胞、组织或器官开始的培养。第32页/共54页 7.cell line(7.cell line(细胞系细胞系细胞系细胞系)：原代培养物经首次传代成：原代培养物经首次传代成：原代培养物经首次传代成：原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系功后即成为细胞系功后即成为细胞系功后即成为细胞系。8.Clone(8.Clone(克隆克隆克隆克隆)：单个细胞通过有丝分裂形：单个细胞通过有丝分裂形：单个细胞通过有丝分裂形：单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。成的细胞群体，他们的遗传特性相同。成的细胞群体，他们的遗传特性相同。成的细胞群体，他们的遗传特性相同。9.Confluence(9.Confluence(汇合汇合汇合汇合)：指在细胞培养瓶中培：指在细胞培养瓶中培：指在细胞培养瓶中培：指在细胞培养瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的养的细胞彼此汇合形成单层，注意与细胞融合的区别。区别。区别。区别。第33页/共54页 10.Contact inhibition(10.Contact inhibition(接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制)：当一个贴壁生长的体外：当一个贴壁生长的体外：当一个贴壁生长的体外：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂正常细胞生长至与另一个细胞相互接触时，便停止了分裂正常细胞生长至与另一个细胞相互接触